[发明专利]一种产紫杉醇微生物的鉴定方法

权利要求书

1.一种产紫杉醇微生物的鉴定方法，其特征在于产紫杉醇微生物的鉴定方法是通过以下步骤实现的：

一、供鉴定溶液的制备：将微生物发酵培养物过滤得微生物菌体和过滤液，然后将微生物菌体粉碎，得到能经过20目标准筛的破碎微生物菌体，然后用乙酸乙酯提取，再经过滤得到微生物菌体乙酸乙酯提取液；将过滤液用乙酸乙酯萃取3次，再将萃取液合并得过滤液乙酸乙酯萃取液，然后再将微生物菌体乙酸乙酯提取液和过滤液乙酸乙酯萃取液合并得总乙酸乙酯提取液，然后向总乙酸乙酯提取液中加入无水硫酸钠脱水，得到微生物培养物无水乙酸乙酯提取液，即为供鉴定溶液，其中用于提取的乙酸乙酯的体积与破碎微生物菌体重量的比例为10mL∶1g，过滤液与萃取剂乙酸乙酯的体积比为1∶1；

二、初步鉴定：取步骤一制备得到的供鉴定溶液，按体积比为500∶1的比例将供鉴定溶液浓缩，得到样品液，然后取紫杉醇溶液作为对照品溶液，然后将样品液和对照品溶液并列点样于硅胶G薄层板上进行层析，控制样品液与对照品溶液的点样体积一致，以环己烷、异丙醇和甲醇按体积比为30∶1∶1的比例混合的混合溶液作为展开剂，展层至薄层板上端1厘米处，然后取出晾干，然后再用浓度为1％的香草醛浓硫酸溶液喷板显色；

三、与紫杉醇对照品Rf值相同部位上出现蓝色斑点的微生物进行确认鉴定：

a、样品检测液的制备：取该微生物步骤一中制备得到的供鉴定溶液，首先让供鉴定溶液流过装有吸附剂的带有筛板的柱子，然后用乙酸乙酯洗涤吸附剂后，负压抽干，再用洗脱液对吸附剂进行洗脱处理得洗脱液，然后将洗脱液在低于50℃条件下蒸干得固形物，再将固形物用2mL乙腈溶液溶解得到样品检测液，其中，吸附剂为氨基键合硅胶，洗脱液为乙酸乙酯和无水乙醇按体积比5～9∶1的比例混合的混合溶液，吸附剂质量与乙酸乙酯溶液体积的比例为1g∶200～1000mL，吸附剂质量与洗脱液体积的比例为1g∶1～20mL；

b、确认鉴定：采用高效液相色谱法进行，以苯基柱为高效液相柱，以乙腈和双蒸水按体积比4∶6的比例混合的混合溶液为流动相，检测波长为230nm，流速为1mL/min，量取a步骤中制备得到的样品检测液，上样检测，检测样品出现与紫杉醇对照品高效液相色谱谱图上一致的物质峰，即可确认此微生物为产紫杉醇微生物。

2.根据权利要求1所述的一种产紫杉醇微生物的鉴定方法，其特征在于步骤二中紫杉醇溶液的浓度为1mg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的一种产紫杉醇微生物的鉴定方法，其特征在于步骤二中将样品液和对照品溶液并列点样于硅胶G薄层板上进行层析，控制样品液与对照品溶液的点样体积一致，为20μL。

4.根据权利要求1或2所述的一种产紫杉醇微生物的鉴定方法，其特征在于步骤三的a步骤中吸附剂质量与乙酸乙酯体积的比例为1g∶300～800mL。

5.根据权利要求1或2所述的一种产紫杉醇微生物的鉴定方法，其特征在于步骤三的a步骤中吸附剂质量与乙酸乙酯体积的比例为1g∶500mL。

6.根据权利要求1或2所述的一种产紫杉醇微生物的鉴定方法，其特征在于步骤三的a步骤中吸附剂质量与洗脱液体积的比例为1g∶3～10mL。

7.根据权利要求1或2所述的一种产紫杉醇微生物的鉴定方法，其特征在于步骤三的a步骤中吸附剂质量与洗脱液体积的比例为1g∶5mL。

8.根据权利要求1或2所述的一种产紫杉醇微生物的鉴定方法，其特征在于步骤三的a步骤中洗脱液为乙酸乙酯和无水乙醇按体积比5.7∶1的比例混合的混合溶液。

9.根据权利要求1或2所述的一种产紫杉醇微生物的鉴定方法，其特征在于步骤三中绘制对照品溶液的以紫杉醇浓度为横坐标，紫杉醇出峰面积为纵坐标的标准曲线，从而推算出样品检测液中紫杉醇的含量，进而推算出紫杉醇产量。