[发明专利]一种新的宫颈癌细胞株（N-Caski）及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的宫颈癌细胞株（N-Caski）。该细胞株，通过慢病毒载体的构建及转导，实现了对HPV16型致癌基因E6/E7的稳定干扰。

背景技术

宫颈癌是女性仅次于乳腺癌第二大常见的恶性肿瘤，全世界每年新发宫颈癌约46.6万，我国就有13万左右，占1/4强。近年来，宫颈癌发病呈现出不断上升、发病过程缩短和年轻化趋势。经证实高危HPV感染是宫颈癌发病关键的和必要的致病因素，作为宫颈癌的致病因子，HPV的特点是：1）流行广泛—感染率15%～40%，其中的15～20%HPV持续性感染；2）传播途径确定—性传播；3）作用机制明确，而HPV E6E7癌基因则是导致和维持宫颈癌恶性表型的关键基因。基于宫颈癌和HPV 的特点，若能对高危HPV持续阳性患者进行高危HPV癌基因的表达的阻断，就能阻断HPV的致癌作用，从而阻断宫颈癌前病变和宫颈癌的发生。这对减少宫颈癌的发生具有现实的重要意义。正因如此，宫颈癌高危HPV阻断治疗方法的研究是当今的热点之一，而最具潜力的技术就是RNA干扰技术。而宫颈癌也有望成为基因阻断技术(RNAi)治疗癌症的第一个理想模型。

HPV16 E6、E7 siRNA作用于人宫颈癌细胞株的实验研究(第五届中国肿瘤学术大会暨第七届海峡两岸肿瘤学术会议、国际肿瘤细胞与基因治疗学会会议、第二届中日肿瘤介入治疗学术会议论文集 , 2008 年)设计E6、E7 siRNA,经脂质体包裹后转染两株细胞,通过对转染前后各时间段两基因mRNA及蛋白的表达情况的检测,验证RNAi作用的特异性及时效性。为探讨使用siRNA治疗宫颈癌的可行性提供实验基础。

两株宫颈癌细胞株中HPV_(16)E_6/E_7蛋白的表达（现代预防医学, Modern Preventive Medicine, 编辑部邮箱 2004年 04期 ）探索及检测宫颈癌细胞株 Caski、 Si Ha细胞内 HPV1 6 (16型人乳头瘤病毒 ) E6 /E7蛋白含量 ,筛选宫颈癌基因治疗研究的合适细胞株。

RNA干扰技术抑制HPV16 E6基因表达对宫颈癌细胞株CaSki增殖的影响(四川大学学报(医学版), Journal of Sichuan University(Medical Science Edition), 编辑部邮箱 2008年 01期 ) 观察HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)能否抑制宫颈癌细胞生长,并探讨其作用机理。

但是，现有RNA干扰技术中SiRNA及质粒转染的短效性，在研究中需要多次转染，这无疑会增加了人力投入及研究成本。

发明内容

为了解决现有RNA干扰技术中存在的技术问题，本发明的第一个目的是提供一种新的宫颈癌细胞株，该宫颈癌细胞株可直接用于研究中各项相关指标的检测，省时省事。本发明的第二个目的是提供上述的宫颈癌细胞株的建立方法。本发明的第三个目的是提供上述的宫颈癌细胞株的应用。本发明的第四个目的是提供用于构建上述的宫颈癌细胞株SiRNA序列。

为了实现上述第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种新的宫颈癌细胞株，该宫颈癌细胞株（N-Caski）保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO. C2010128。

为了实现上述第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种如权利要求1所述的宫颈癌细胞株的建立方法，该方法包括以下步骤：

1）选取针对HPV16型E6/E7共同启动子区的干扰效果较好的SiRNA序列,并设计符合慢病毒载体要求的shRNA序列，shRNA序列的编码链序列如SEQ ID NO:1所示，随从链序列如SEQ ID NO:2所示；

2）构建宫颈癌HPV16 E6/E7启动子基因shRNA重组慢病毒载体，筛选出高滴度慢病毒；

3）转导Caski细胞，抗生素筛选稳转细胞。

作为优选，上述的载体选用pLenti6/BLOCK-iT-DEST载体。

为了实现上述第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

上述的宫颈癌细胞株（N-Caski）用于作为宫颈癌HPV16 E6/E7癌基因的致病机制的探讨及相关信号通路的研究的细胞模型。

上述的宫颈癌细胞株（N-Caski）用于宫颈癌治疗药物的挑选及验证。

为了实现上述第四个目的，本发明采用了以下的技术方案：

shRNA序列，该shRNA序列的编码链序列如SEQ ID NO:1所示，随从链序列如SEQ ID NO:2所示。