[发明专利]有机溶剂应答的表达载体及其在生物催化中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的有机溶剂表达载体及其应用，具体为一种用有机溶剂应答启动子P_srp构建的有机溶剂应答的表达载体及其在生物催化中的应用。

背景技术

生物催化在合成精细化学品和生物修复领域具有广泛的应用潜力。作为一钟节能、环境友好、安全和有效的方法，全细胞催化正在吸引越来越多的关注。在生物催化中常常要接触到有机溶剂。比如在生物催化过程中为了增加反应物的溶解性或者避免产物的分解等原因常常要引入含有有机溶剂的双液相反应；在许多需要进行生物修复的污染区域也充斥着各种各样的达到饱和浓度的有机溶剂，比如苯、甲苯、二甲苯等。对于普通微生物而言，有机溶剂是有毒的，因为有机溶剂能够破坏生物大分子的结构，并且能够在细胞膜上积累从而打乱磷脂双层的有序结构，进而破坏细胞膜的结构和功能的完整性。有机溶剂的毒性是生物催化在环境和精细化学品生产领域应用的一大障碍。

自1989年第一株耐有机溶剂微生物被分离以来，人们已经从各种生态环境中分离到大量耐有机溶剂微生物，其中以恶臭假单胞菌为多。这些微生物是极端微生物的一种，它们通过细胞膜的坚固化，表达有机溶剂外排泵等方法来对抗有机溶剂的毒害。耐有机溶剂微生物在生物催化的诸多领域都具有重要的应用潜力，比如生物修复，精细化学品合成等。恶臭假单胞菌具有着诸多让人惊奇的特点，比如恶臭假单胞菌具有强大的代谢能力，几乎可以降解任意形式的芳香族和脂肪族化合物，包括一些剧毒的化合物。恶臭假单胞菌还是土壤微生物中的主要类群，是一种比较安全的菌株，因而，在重组DNA技术和环境应用中有着较大的发展潜力。尤其值得关注的是，恶臭假单胞菌的某些菌株具有耐受有机溶剂的能力，这使得它们在工业催化和环境领域成为非常有用的菌株。这其中恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)S12是一个杰出的代表(Ruijssenaars H，2007，J.Biotechnol.131：S205-S206)，这株菌正在被开发成为用糖类化合物生产芳香化合物的平台菌株。然而，这些耐有机溶剂微生物往往不具备人们想要的催化活性，因此要利用有机溶剂耐受菌进行催化或者环境修复就需要使用基因工程的手段对这些微生物进行改造，以赋予其独特的催化能力，扩展微生物的应用范围，使其能够用适合于各种工业和环境需求。

异源表达系统是改造微生物，扩展微生物菌株应用范围的有力工具，已经在生物催化中被广泛的应用，比如精细化学品生产、生物修复和生物脱硫。合适的异源表达系统不仅可以使微生物的菌株改造或者构建变得容易，而且可以赋予基因工程菌优良的特性，使得利用生物催化剂进行的大规模生产更经济可行。目前，仅有少量的基因操作工具可以在有机溶剂耐受的恶臭假单胞菌中使用，而且现存的操作工具大都是基于大肠杆菌乳糖操纵子的，诱导时需要使用价格昂贵的IPTG作为诱导物，这限制了它们在工业和环境领域的应用。

启动子P_srp是有机溶剂耐受菌株恶臭假单胞菌(P.putida)S12的有机溶剂外排泵基因的启动子，该启动子可以在多种廉价有机溶剂诱导下启动基因的转录，比如可以在芳香烃、烷烃和醇类的诱导下启动下游基因的转录。而且，该启动子对于普通的环境压力比如pH、温度、盐浓度或者有机酸没有应答，这一特点将使得其下游基因更容易被人控制。尤其值得注意的是，这些有机溶剂同时也是工业生物催化中常用的溶剂，并且在污染环境中也时常存在。这一启动子用作表达载体的基因表达调控元件，将具有很大的优势，不仅可以用廉价的有机溶剂替代昂贵的IPTG，降低生物催化的诱导成本，还可以方便的直接利用微生物工业和环境中存在的有机溶剂对基因的表达进行诱导，节约操作步骤，降低成本。因此，该启动子在生物催化尤其是双液相反应和环境生物修复领域降具有很大的应用潜力。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，提出了一种有机溶剂应答的表达载体及其在生物催化中的应用，本发明用有机溶剂应答启动子P_srp构建，表现了较好的经济性和有效性，远好于用普通IPTG诱导载体构建的基因工程菌。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种有机溶剂应答的表达载体，具体为有机溶剂应答的宽宿主组成型表达载体。