[发明专利]一种制备脱氧核糖核苷三磷酸的新方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种利用化学合成-酶促合成两步法的全新工艺，用料价格低廉，生产成本较低，无环境污染，可大规模制备脱氧核糖核苷三磷酸。

背景技术：

DNA合成的基础物质是脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，根据其结构的不同，dNTP可分为dATP、dCTP、dTTP、dGTP。人工合成的DNA片段已广泛应用于基因工程和分子生物学等生命科学领域。虽然dNTP的制备研究曾有不少报道，如Yoskihawa等用POCl₃将脱氧核苷磷酰化得到以脱氧核苷二氯磷酸为主的产物；Ludwig发现脱氧核苷二氯磷酸可以在中性无水DMF溶液中与过量的焦正磷酸三丁胺反应生成核苷三磷酸等等。但所有这些方法均有一定的缺陷，大部分的生产方法的合成量在1mmol以下，化学法合成法的后处理相当困难，且收率极低，产品中存在的焦磷酸盐将影响DNA聚合酶的催化活性，从而影响DNA的合成。

发明内容：

本发明所述脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法包括以下步骤：

正磷酸三丁胺的制备：三正丁胺100-150ml，85％磷酸40-60ml，以1000ml乙醇为溶剂，室温下搅拌反应半小时，之后在40℃水浴中旋转蒸发至糖浆状。然后分别用500ml无水乙醇溶解，减压蒸干三次，残留物为微黄色透明糖浆状正磷酸三丁胺。

dNDP的化学合成：dNMP水溶液用盐酸调pH值为4-6，加入5-10倍物质量的DCC、4-8倍物质量的正磷酸三丁胺，以等体积的乙醇作为溶剂，80℃搅拌反应10小时，冰浴100min后过滤除去不溶物，所得液体在40℃条件下旋转蒸发除去乙醇，得到的混合物加入50-60倍体积的水溶解，用氢氧化钠调溶液的pH为6-8，所得混合物为dNMP、dNDP和磷酸盐的水溶液，其中含dNDP70％-90％，经阴离子树脂柱层析分离，以醋酸、醋酸钠的缓冲液为洗脱剂，0.1-0.5mol/L的浓度梯度洗脱，得到纯度为97％-99％的dNDP水溶液，再加入2倍溶液体积的无水乙醇使其沉淀，沉淀在40℃水浴条件下旋转蒸发可得到白色的dNDP固体粉末。

dNTP的酶促反应：dNDP水溶液中加入4-6倍物质量的PEP-Na，用氢氧化钠溶液调节pH为6-8，以ATP-Na为催化剂，根据酶的活性加入丙酮酸激酶和金属离子，如氯化锂、硫酸锂、醋酸锂、七水硫酸镁、氯化钾、硫酸钾等；在50-60℃条件下进行酶促反应48-72小时，即可得到dNDP和dNTP的混合物，dNTP的含量在60％-80％之间，将该混合物用阴离子树脂柱层析分离，以醋酸、醋酸钠的缓冲液为洗脱剂，0.1-0.5mol/L的浓度梯度洗脱，得到纯度为97％-99％的dNDP水溶液，再加入2倍溶液体积的无水乙醇使其沉淀，沉淀在40℃水浴条件下旋转蒸发可得到白色的dNTP固体粉末。

本发明以dNMP为原料，采用化学合成-酶促合成相结合的方法合成dNTP。在dNMP合成dNDP的过程中，dNDP的收率为70％-90％，dNDP再经酶促反应生成dNTP的过程中，dNTP的收率在60％-80％之间，且未反应的dNDP可回收用于下次继续反应，原料没有损耗，适合工业循环生产，且无废气、废物环境污染。

具体实施方式：

实施例1正磷酸三丁胺的制备

取三正丁胺200ml、85％磷酸90ml，以2000ml乙醇为溶剂，室温下搅拌反应半小时，之后在40℃水浴中旋转蒸发至糖浆状。然后分别用1000ml无水乙醇溶解，减压蒸干三次，得残留物为微黄色透明糖浆状正磷酸三丁胺250克左右。

实施例2 dNDP的化学合成

称取dNMP固体100克，溶于500ml去离子水中，用盐酸调溶液pH值为5，加入300克的DCC、250克正磷酸三丁胺，以1000ml的乙醇作为溶剂，80℃搅拌反应10小时，反应之后冰浴100min，过滤除去不溶物，所得液体在40℃水浴条件下旋转蒸发除去乙醇，得到的混合物加入800ml的水溶解，用氢氧化钠调溶液的pH为中性，所得混合物为dNMP、dNDP和磷酸盐的水溶液，用阴离子树脂柱层析分离，以醋酸、醋酸钠的缓冲液为洗脱剂，0.1-0.5mol/L的浓度梯度洗脱，得到纯度为97％-99％的dNDP水溶液，再加入2倍溶液体积的无水乙醇使其沉淀，沉淀在40℃水浴条件下旋转蒸发可得到白色的dNDP固体粉末100克，以dNMP为原料计算，本步收率为83.1％。

实施例3 dNTP的酶促合成

称取dNDP固体100克，溶于500ml去离子水中，加入200克的PEP-Na，溶液用氢氧化钠溶液调pH为中性，加入0.5克ATP-Na、1.5万单位的丙酮酸激酶和50毫克的金属离子，如氯化锂、硫酸锂、醋酸锂、七水硫酸镁、氯化钾、硫酸钾等；在50-60℃条件下进行酶促反应48-72小时，即可得到dNDP和dNTP的混合物，将该混合物用阴离子树脂柱层析分离，以醋酸、醋酸钠的缓冲液为洗脱剂，0.1-0.5mol/L的浓度梯度洗脱，得到纯度为97％-99％的dNDP水溶液，再加入2倍溶液体积的无水乙醇使其沉淀，沉淀在40℃条件下旋转蒸发可得到白色的dNTP固体粉末80克。本步的收率为72.5％，如以dNMP为起始原料计算，总收率为60.4％。