[发明专利]检测嗜肺军团菌多种血清型致病菌特异性引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种多重PCR快速检测的方法及其应用，尤其涉及一种可同时用于检测嗜肺军团菌血清型1型(Legionella pneumophila serogroup 1)，4型(Legionellapneumophila serogroup 4)，6型(Legionella pneumophila serogroup 6)，10型(Legionella pneumophila serogroup 10)和13型(Legionella pneumophila serogroup13)五种致病菌的PCR技术及其所用PCR引物的序列。

背景技术

军团菌(Legionella)在1976年“费城军团病事件”中首次被发现，并因此而得名。军团菌是一种兼性细胞内寄生菌，广泛存在于自然界及人工水体、土壤环境中，吸入污染有军团菌的气溶胶，饮用污染或创面接触污染水源等，都有可能导致军团菌的感染，由军团菌引发的急性发热性肺部疾病——军团病为人畜共患疾病，相继已有多个国家和地区报道该病可在马、牛、羊、猪和犬等动物中的发生和流行。受感染的人和动物排出的军团菌污染环境、土壤和水源，成为本病的传染来源。美国、英国、加拿大、荷兰、瑞典和西班牙等30多个国家和地区相继报道了军团病在马、牛、羊、猪和犬等动物中的发生和流行。据报道，我国沈阳、成都地区部分畜禽的血清学调查，牛、羊、猪、鸡、鸭、鹅和狗均检出不同程度军团病阳性抗体，感染率为10.3％-55.5％。

目前已确认军团菌有50个种，70多个血清型，其中嗜肺军团菌与人类疾病关系最为密切。根据O-抗原的不同，嗜肺军团菌可分为15个血清型。其中大约有70％的军团菌感染是由嗜肺军团菌O1引起的，20-30％是由其它血清型引起的，非嗜肺军团菌导致约5-10％的军团菌感染。

目前，很多分子分型方法应用于军团菌分型研究，但大部分方法没有标准化，传统的血清学分型鉴定的不足之处在于其容易受环境因素的影响，且可能与他菌种之间存在共同抗原而出现交叉反应，而由此发展而来的单克隆抗体分型同样存在稳定性差的缺陷。

随着分子技术特别是PCR技术的发展，许多分子生物学方法被用于军团菌分子分型 和流行病学研究。目前已用于军团菌分型的4种常用分子分型技术为：随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、脉冲场凝胶电泳(Pulsed-Field GelElectrophoresis，PFGE)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP)、核酸测序分型(sequence-based typing，SBT)。由于其一次即可分离出大量DNA片段，且具有操作简便，重复率好等优势，先后用于军团菌分子分型和流行病学调查。

1988年，自Chamberlain et al首先报道采用多重PCR诊断杜氏肌营养不良症(DMD)以来，已被成功的用于基因组结构与功能基因、突变与多态性，以及定量分析与反转录PCR等多个DNA检测领域。[Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophylocus via multiplex DNA amplification。Nucleic Acids Res，1988，16：11141～11156]，可在同一反应体系中加入一对以上的特异的引物对，如果存在与各引物对特异互补的模板，则可同时在同体反应体系中扩增出一条以上的目的DNA片段，从而检测出对应的致病菌。该方法对检测致病菌具有快速、敏感、特异性强的优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对嗜肺军团菌中常见血清型的多重PCR快速检测技术，并建立了相应的多重PCR检测试剂盒，为快速检测与鉴定常见致病菌提供有效的手段。所用引物的序列包含以下序列中选取的一种或多种：

(1)嗜肺军团菌血清型1型和6型wzt基因，4型，10型和13型wzm基因的特异核苷酸序列；

(2)上述(1)中选取的核苷酸序列的互补DNA序列。

上述的引物序列可用于制备检测嗜肺军团菌多种血清型用PCR试剂盒、基因芯片或微阵列。所述嗜肺军团菌血清型取样于自来水、矿泉水、空调冷却水的培养物的粗提液，或是嗜肺军团菌1型，4型，6型，10型和13型的纯培养物的粗提液。