[发明专利]分离自猿腺病毒血清型19的六邻体、其高变区和使用其的嵌合型腺病毒

说明书

技术领域

本发明涉及分离自猿腺病毒血清型19(“SAd19”)的新六邻体，其高变区(“HVR”)，使用其的嵌合型腺病毒及其治疗用途。

背景技术

腺病毒属于腺病毒科(Adenoviridae)，其于1953年首次分离。根据基因组的相似性、致癌性和血液凝固特性，将人腺病毒分为六(6)个亚属(A至F)。腺病毒感染大多数非分裂细胞如肌肉细胞、肺细胞、脑细胞和心脏细胞，其分子生物学特征为本领域所熟知。腺病毒基因组由35kb的线性、双链DNA组成，其在宿主细胞中的复制依赖于病毒蛋白E1A。

通过使用将其E1A删除后的非复制性载体，可对上述腺病毒的特征加以利用。由于插入有腺病毒E1基因的HEK293细胞系的研制，腺病毒载体系统已经应用于许多研究中，其导致了利用宿主细胞的细胞毒性的病毒疗法的发展。2005年在中国商业化的融瘤病毒治疗剂安柯瑞是E1B55-缺失型腺病毒，其用于在p53-缺失型肿瘤中选择性诱导凋亡性细胞死亡。

在开发选择性复制的腺病毒治疗剂的过程中，最重要的是E1A蛋白的选择性表达，已经有很多案例表明使用肿瘤选择性表达启动子与可能的肿瘤-选择性腺病毒基因治疗剂有关。大多数肿瘤-选择性腺病毒是使用通常发现的人腺病毒血清型5(“HAd5”)制备的。据报道，由于HAd5占80%的普遍性，因此人具有高水平的腺病毒中和抗体(Appaiahgari,M.B.等人，(2007)临床及疫苗免疫学(Clinical and Vaccine Immunol.)14,1053-1055)。针对腺病毒衣壳蛋白的这些中和抗体影响腺病毒系统用药的药效和毒性(Chen,Y.等人，(2000)人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)11,1553-1567)。

病毒衣壳由三(3)种蛋白即六邻体、纤毛和五邻体组成，其包括具有由240个六邻体和12个五邻体组成的对称二十面体结构的壳粒(capsomere)。每个五邻体均结合突出的70~100nm的三聚体纤毛。当被腺病毒感染时，三聚体纤毛在腺病毒感染过程中附着于宿主细胞表面膜上的柯萨奇腺病毒受体(CAR)。五邻体的RGD区结合至整合蛋白，其导致病毒吸附并侵入至宿主细胞内。

据报道，六邻体蛋白的环1(L1)和环2(L2)暴露于病毒壳粒结构的外部。L1和L2分别含有六邻体蛋白的六(6)个高变区(HVRs)，即在第132至320个氨基酸内的HVR-1至HVR-6，以及第408至459个氨基酸内的第7个HVR(HVR-7)。

腺病毒提供了优良且有效的将治疗基因转入细胞的方式。然而，使用腺病毒载体进行体内基因转移的一个问题是会产生针对腺病毒衣壳蛋白上抗原表位的抗体。

当腺病毒施用于人体时，形成了针对六邻体蛋白的中和抗体，该抗体主要靶向显性HVR区。也已知该抗体通过抑制宿主细胞感染而降低病毒复制效率(Wohlfart,C.(1988)J.Virol.62,2321-2328；Toogood,C.I.A.等人，(1992)J.Gen.Virol.73,1429-1435；Sumida,S.M.等人，(2005)J.Immunol.174,7179-7185)。

当使用病毒基因递送载体和病毒治疗剂而施用腺病毒时，必须解决由针对人HAd5的人中和抗体占多数导致的问题。除了上述与中和抗体相关的问题，也有报道说当全身接触时腺病毒感染肝脏。在这方面，有报道说腺病毒具有嗜肝性，当通过静脉途径施用腺病毒时，24小时内其90%转移至肝脏中(Worgall,S.等人，(1997)人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)8,37-44)。由于腺病毒的这种肝选择性，1999年年轻患者Jessie Gelsinger在施用腺病毒基因治疗剂的临床试验中发生了急性肝中毒。此后，腺病毒剂量一直被限制在不超过1×10¹³vp。因此，通常肝中毒被认为是使用腺病毒的许多基因治疗剂进行非临床/临床试验的剂量限制因素(Alemany,R.等人(2001)基因治疗(Gene Ther.),8(17),1347-1353；Christ,M.等人，(2000)人类基因治疗(Hum.Gene Ther.),11(3),415-427；Lieber,A.等人，(1997)J.Virol.,7(11),8798-8807)。这种肝选择性是腺病毒治疗剂进行系统用药时实现有效治愈的主要问题(Worgall,S.等人，(1997)人类基因治疗(Hum.Gene Ther.),8,37-44)。