[发明专利]用于在巯基-二硫键氧还酶缺陷的细菌突变体细胞中产生异源多肽的方法

说明书

涉及序列表

本发明涉及计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及巯基-二硫键氧还酶(thiol-disulfide oxidoreductase)缺陷细菌突变体细胞和在此类巯基-二硫键氧还酶缺陷细菌突变体细胞中产生异源多肽的方法。

背景技术

多肽链的折叠依赖于分子伴侣和折叠催化剂，如巯基-二硫键氧还酶。巯基-二硫键氧还酶催化巯基/二硫键交换反应并促进二硫键形成、异构化或还原，由此协助正确的二硫键配对的形成(Hart等,1995,Current Opinion in Structural Biology 5:92-102)。此类氧还酶直接与新合成的分泌蛋白相互作用，并且是在真核细胞内质网(ER)中初生多肽的折叠所必需的。

由于其表达和分泌其产物的能力，芽孢杆菌属细菌(Bacilli)已在工业上充分确立为用于重组产生异源蛋白的宿主细胞系统。然而，具有理想的蛋白表达和分泌性状的芽孢杆菌属(Bacillus)宿主细胞并不一定对于生物活性异源蛋白的产生具有最理想的特征。对于宿主细胞为天然的巯基-二硫键氧还酶的存在可在异源蛋白中催化不正确的二硫键配对的形成。

Meima等,2002,Journal of Biological Chemistry 277:6994-7001公开了编码感受态形成(competence development)所需的巯基-二硫键氧还酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的bdbCD操纵子。Erlendsson和Hederstedt,2002,Journal of Bacteriology 184:1423-1429公开了巯基-二硫键氧还酶BdbC和BdbD中的突变可抑制CcdA缺陷枯草芽孢杆菌细胞的细胞色素c缺乏。

美国专利号6,521,421和7,037,714公开了编码枯草芽孢杆菌二硫键异构酶的表达载体和使用该载体在革兰氏阳性微生物中分泌蛋白的方法。

本发明提供了用于产生异源蛋白的巯基-二硫键氧还酶产生缺陷的改善的细菌宿主细胞，以及在此类巯基-二硫键氧还酶缺陷细菌突变体细胞中产生异源多肽的方法。

发明内容

本发明涉及亲本细菌细胞的分离的突变体，其包含编码包含两个或更多个(几个)半胱氨酸的异源多肽的第一多核苷酸，和包含编码不正确地催化所述异源多肽的两个或更多个(几个)半胱氨酸之间的一个或多个(几个)二硫键形成的巯基-二硫键氧还酶的基因的修饰的第二多核苷酸，其中所述突变体细胞在相同条件下培养时相对于亲本细菌细胞在巯基-二硫键氧还酶产生方面是缺陷的。

本发明还涉及产生异源多肽的方法，包括：

(a)在用于产生所述异源多肽的培养基中培养亲本细胞的突变体，其中(i)所述突变体细胞包含编码包含两个或更多个(几个)半胱氨酸的异源多肽的第一多核苷酸，和包含编码不正确地催化所述异源多肽的两个或更多个(几个)半胱氨酸之间的一个或多个(几个)二硫键形成的巯基-二硫键氧还酶的基因的修饰的第二多核苷酸，和(ii)所述突变体细胞在相同条件下培养时相对于亲本细菌细胞在巯基-二硫键氧还酶产生方面是缺陷的；和

(b)从培养基回收所述异源多肽.

本发明进一步涉及获得亲本细菌细胞的突变体的方法，包括：

(a)向所述亲本细菌细胞导入编码包含两个或更多个(几个)半胱氨酸的异源多肽的第一多核苷酸，和包含编码不正确地催化所述异源多肽的两个或更多个(几个)半胱氨酸之间的一个或多个(几个)二硫键形成的巯基-二硫键氧还酶的基因的修饰的第二多核苷酸；和

(b)鉴定包含修饰的多核苷酸的来自步骤(a)的突变体细胞，其中所述突变体细胞在巯基-二硫键氧还酶产生方面是缺陷的。

附图说明

图1显示pNNB194-ispAΔ的限制图。

图2显示pMOL2657的限制图。

图3显示pRB217的限制图。

图4显示pRB219的限制图。

图5显示pSMO280的限制图。

图6显示pIC20R-amyL的限制图。

图7显示pHP13ampMCS-amyL的限制图。

图8显示pSJ2882-amyL orf的限制图。

图9显示pMRT135的限制图。