[发明专利]用于改进重组蛋白表达的方法

说明书

相关申请的交叉引用 

本申请案要求2009年8月6日提交的题为“Methods for Improving Recombinant Protein Expression”的美国临时申请案第61/231,906号的优先权利益，此申请案的代理人案号为31351/44743，其全文以引用的方式并入本文。 

技术领域

本发明借助于增加载体上的选择压力，从而增加载体相关的异源蛋白表达，在真核细胞中的重组蛋白表达领域中具有实际应用。 

背景技术

在重组蛋白产生领域中，增加转染基因的表达是细胞系发育期间的基本首要工作。改进转录、翻译、蛋白质折叠和分泌是增加异源蛋白效价的密集研究的所有目标。 

无论过去所用方法如何，本领域中需要提供增加所需蛋白的产率的较好的用于重组蛋白产生的方法。 

发明内容

一方面，本发明提供一种用于增加宿主细胞中的异源蛋白表达的方法，所述方法包括以下步骤：在允许蛋白表达的条件下培养包含编码所述异源蛋白的第一异源多核苷酸序列的宿主细胞，所述第一多核苷酸在载体上编码，所述宿主细胞进一步包含具有针对选择标记蛋白的蛋白编码序列的第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸与编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸相比具有序列修饰，所述序列修饰降低由所述第二多核苷酸编码的mRNA的翻译效率，具有所述序列修饰的所述第二多核苷酸和所述野生型多核苷酸编码针对所述选择标记蛋白的相同氨基酸序列。一方面，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在单个载体中，且在这方面的一个实施方案中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸各自受不同启动子的转录控制。在其它方面，所述第一多核苷酸和所 述第二多核苷酸在独立载体中。另一方面，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸受相同启动子的转录控制。 

在所述方法的一个实施方案中，所述修饰在编码所述选择标记蛋白的第二多核苷酸的非翻译区中，且在某些方面，所述修饰在5′非翻译区中和/或所述修饰在3′非翻译区中。 

在所述方法的另一实施方案中，所述修饰在编码所述选择标记蛋白的基因的蛋白编码区中。一方面，所述修饰在针对选择标记基因编码序列的蛋白编码区的起始密码子的25、20、15、10或5个密码子中。 

在所述方法的另一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，所述被修饰的密码子作为密码子，并非是针对所述宿主细胞编码的所述氨基酸的偏好密码子。一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，所述被修饰的密码子作为密码子，是针对所述宿主细胞编码的所述氨基酸的最不偏好密码子。 

在所述方法的另一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，且所述修饰在所述mRNA的二级结构中引入了降低所述mRNA的翻译效率的变化。在所述方法的一个实施方案中，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，且所述修饰增加mRNA中的密码子配对。在所述方法的另一实施方案中，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，且所述修饰改变mRNA的G+C含量。在多个方面，所述修饰增加mRNA的G+C含量，且在多个方面，G+C含量增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。在其它方面，G+C含量增加超过100%。