[发明专利]纯化vwf以增加非-脂质包封的病毒的去除

说明书

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2009年8月20日提交的美国临时申请No.61/235,570的优先权权益，其公开内容通过引用的方式全部并入本文。

技术领域

通常，本发明涉及纯化VWF以增加非-脂质包封的病毒的去除的方法。

背景技术

Von Willebrand因子(VWF)以大小为约500至20,000kD的范围的一系列多聚体在血浆中循环的糖蛋白。VWF的多聚体形式由通过二硫键连接在一起的250kD的多肽子单元构成。VWF介导初始血小板粘附损坏的血管壁的内皮下。只有较大的多聚体表现出止血活性。假设内皮细胞分泌加大的聚合物形式的VWF，并且具有低分子量的那些形式(低分子量VWF)源自蛋白水解分裂。具有较大分子量的多聚体储存在内皮细胞的Weibel-Pallade体中，并且在刺激时释放。

VWF由作为前原-VWF的内皮细胞和巨核细胞合成，所述前原-VWF由较高程度的重复结构域构成。在信号肽分裂时，原-VWF通过其C-末端区域的二硫键连接而形成二聚体。所述二聚体起到多聚化的原体的作用，其由游离末端之间的二硫键连接控制。装配成多聚体后进行蛋白水解以除去前肽序列(Leyte et al.，Biochem.J.274(1991)，257-261)。

从VWF的克隆cDNA预测的初级翻译产物是2813-残基前体多肽(前原-VWF)。前原-VWF由22个氨基酸信号肽和741个氨基酸前肽构成，其中成熟VWF包含2050个氨基酸(Ruggeri Z.A.，and Ware，J.，FASEB J.，308-316(1993))。

VWF中的缺陷引起Von Willebrand病(VWD)，其特征在于或多或少显著的出血显型。3型VWD是最严重的形式，其中VWF完全缺失，并且1型VWD涉及VWF的定量损失，其显型可以是非常温和的。2型VWD涉及VWF的定性缺陷并且可以和3型VWD一样严重。2型VWD具有多种亚型形式，一些相关于高分子量多聚体的损失或减少。2a型Von Willebrand综合征(VWS-2A)的特征在于中间体和较大多聚体的损失。VWS-2B的特征在于最高分子量多聚体的损失。涉及VWF的其他疾病和病患是本领域已知的。

来自治疗蛋白溶液的非-脂质包封的病毒的去除或失活传统上通过使用物理方法处理来完成，例如高温(例如，干燥加热、蒸汽加热、巴氏消毒法)、高能量射线的辐射(例如，紫外线(UV)射线或β辐射)、低pH、纳米过滤、或色谱法特别是亲和色谱法。然而，当纯化高分子量蛋白例如VWF时，这些方法通常是无效的，其不通过纳米过滤器和/或在使用加热或辐射处理时失去其效力或分子完整性。

当前管理规范要求生产商提出减少和/或失活脂质包封的和非-脂质包封的病毒以用于重复药物产品的问题。ICH″Guideline on Viral Safety Evaluations of Biotechnology Products″(Federal Register，1998，63(185)：51074-51084)提供生产商灵活性：如何将病毒问题考虑到产品类型中、生产方法和潜在污染性病毒的风险。这些规范指出病毒污染的风险是源自细胞系的所有生物产品共有的特征。这种污染可具有严重的临床后果，并且可源自源细胞系本身的污染(细胞底物)或源自生产中病毒的偶然引入。

而脂质-包封的病毒的失活可以通过溶剂/去污剂(S/D)处理方案非常有效地进行，因为它们较小尺寸和物理稳定性，非-脂质-包封的模型病毒(NLEV’s)的失活或去除可能是挑战性的。

因此，本领域存在需要开发方法以在VWF纯化的过程中有效地失活或去除非-脂质包封的病毒。

发明概述

本发明提供纯化VWF以增加非-脂质包封的病毒的去除的有效方法。本发明提供通过下列步骤纯化VWF以增加NLEV′s的去除的新型方法：进行产物负载步骤；以及在较高pH下纯化方法的洗涤步骤。

本领域已知的从NLEV′s纯化多肽的一种方法涉及使用纳米过滤。使用纳米过滤有效地分离蛋白和病毒中的原理利用了多肽和病毒之间的尺寸差异；有效的分离要求多肽的有效尺寸小于病毒，这允许多肽通过纳米过滤器的孔，而病毒得以保留。然而，如果多肽和病毒相对于彼此具有相当的尺寸，因为多肽和病毒都通过纳米过滤器的孔或都通不过，因此分离是有问题的。本文公开的方法通过下列方式克服了该问题：使用阳离子交换树脂而不是纳米过滤，并且在足够高的pH下负载和/或洗涤树脂以从病毒中分离多肽。