[发明专利]硝基还原酶的新型酶底物

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测硝基还原酶活性的新型酶底物。这些底物可用在特别是微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组织学等包括产生物理化学信号的酶还原步骤的应用中。

背景技术

目前存在非常多的能够检测微生物的培养基。该检测可特别地基于特定底物的使用，所述底物对于期待检测的微生物中的酶具有特异性。通常，对酶的合成性底物的制备方式是使底物和它通过靶酶代谢的产物具有不同的物理化学性质，所述性质使得能够将它们区分，并能够评价是否所有或部分的底物已通过酶转化为产物。例如，酶代谢的产物可以是生色或荧光的。由此，在细菌的情况中，通过底物的选择，根据是否存在反应，可表征微生物的性质。硝基还原酶活性可特别地用于鉴定细菌群、属或种。还可将其用于监测微生物的还原性代谢，如与它们的生长或抑制这样的生长相关的还原性代谢。

多年来已知一些细菌具有还原硝基芳族化合物的能力。Asnis(1957)报道了从大肠杆菌提取物中分离黄素蛋白，黄素蛋白能够还原对硝基苯甲酸。从这篇报道开始，在各种生物体中已鉴定出硝基芳基还原酶活性。这包括严格需氧菌如假单胞菌属(Pseudomonas)(Won等人，1974)和诺卡菌属(Nocardia)(Villanueva，1964)、严格厌氧菌如梭菌属(Clostridium)(Ancermaier和Simon，1983)和韦荣氏球菌属(Veillonella)(McCormick等人，1976)或真菌(Masuda和Ozaki，1993)和真核寄生虫(Douch，1975)。存在着一些被指认能够被细菌性硝基芳基还原酶还原的底物。这些底物尤其为硝基芳族化合物，例如对硝基苯甲酸、对硝基苯酚、对硝基苯胺及2，4，6-三硝基甲苯(McCormick等，1976)。

通常通过间接方法如监测底物或共因子的消失对硝基还原酶的酶活性进行检测。例如，Kitamura等人(1983)已研究了对硝基苯甲酸甲酯和一些其他的硝基芳族化合物与大肠杆菌提取物的还原。但是，该方法不是非常灵敏，并且不适于在非均相培养基中的检测。还可提及申请WO 00/28073，其描述了用于直接检测硝基芳基还原酶活性的基于硝基香豆素的荧光底物。该类型的硝基芳族化合物能够在还原后产生较强荧光的化合物，因此该化合物可易于检测。但是，该底物不能很好地适于非均相培养基中的检测。

发明内容

因此，本发明提出对可进行微生物检测的硝基还原酶底物的改进。相对于现有的底物，这些新型底物易于合成，并且可以特别地用于微生物检测的凝胶培养基，因为它们产生在反应培养基中不扩散的颜色。

此外，本发明相对于现有技术的改进在于本发明的化合物可进行的微生物检测，同时显示出硝基还原酶活性和引起培养基的pH变化的代谢。

在进一步描述本发明之前，给出以下定义以有助于本发明的公开。

“酶底物”是指这样的底物，其可被酶改变成允许直接或间接地检测微生物、细胞或细胞器的产物。在硝基还原酶底物的情况中，该底物特别包括硝酸酯官能团，该官能团可被待检测的酶活性部分或全部地还原，这样的硝酸酯官能团的还原改变分子的某些物理化学性质，使得能够监测该还原。

本发明的底物适用于流式细胞术，因为由于其还原产物主要保留在表达酶活性的细胞内，可以特定地对表达该活性的细胞计数，或者甚至将它们从样品的其余部分中分离。

本发明的底物还较好地适用于组织酶学，这是因为由于还原产物主要保留在还原位点处，所以可特异性地鉴定在组织中表达该活性的细胞或细胞器。

由于它们的低毒性，本发明的底物较好地适于对细胞培养物的硝基还原酶活性的监测。

本发明的底物特别良好地适用于培养基的检测和/或鉴定，这是因为它们产生在反应培养基中不扩散的颜色或荧光。在本申请中，术语“颜色”包括在可见光谱中的颜色、光吸收或在某波长(λ_ex)下吸收且在更高波长下激发的荧光。

本发明的底物可以是盐化的，即可以为如氯盐、溴盐、碘盐、钾盐或三氟乙酸盐的盐形式。

术语“pH指示剂”应理解是指颜色和/或荧光根据培养基的pH变化而改变的化学物质，所述变化与在所述培养基上生长的微生物的代谢相关或不相关。

“硝基还原酶”应理解是指可全部或部分还原NO₂基的酶。