[发明专利]用于PCR的试剂和方法

权利要求书

1.一种用于引物依赖性DNA扩增反应的反应混合物，所述扩增反应包括通过用于扩增至少一个DNA靶序列的DNA聚合酶来引物延伸，所述反应混合物包括至少一个引物对、DNA聚合酶和dNTP，改良处包括：在扩增起始前将至少一个双链寡核苷酸添加物包括在反应混合物内，该双链寡核苷酸添加物具有6-50个核苷酸长的杂交物长度，在32℃下至少50％为双链，在其每条链上具有末端区并且包括1-4个修饰基团，每个修饰基团均共价连接到不同末端区，所述修饰基团为不具有非平面大体积部分的多环部分，其中所包括的所述至少一个双链寡核苷酸添加物的浓度与所述DNA聚合酶浓度有关并且对于以下功能的至少一个是有效的：抑制引导错误、提高聚合酶对具有未完全互补的3’凹端序列的杂交物的选择性、提高聚合酶对具有富含AT的3’凹端序列的杂交物的选择性、减少重复反应间的发散、抑制聚合酶5’核酸外切酶活性、以及抑制聚合酶活性；条件是，如果添加物为任何靶序列的引物或检测探针，则其包括至少三个修饰基团。

2.根据权利要求1所述的扩增反应混合物，其中所述至少一个修饰基团为2-4个修饰基团。

3.根据权利要求2所述的扩增反应混合物，其中所述2-4个修饰基团为3个修饰基团。

4.根据权利要求3所述的扩增反应混合物，其中所述添加物包括：第一链，其为所述至少一个靶序列的引物或探针；和反向互补链，其部分互补于所述第一链。

5.根据权利要求2所述的扩增反应混合物，其中所述2-4个修饰基团为4个修饰基团。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的扩增反应混合物，其中所述修饰基团共价连接到所述至少一个双链寡核苷酸添加物的末端核苷酸。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的扩增反应混合物，其中所述修饰基团为Dabcyl。

8.根据权利要求2所述的扩增反应混合物，其中所述至少一个添加物为两种添加物的混合物。

9.根据权利要求8所述的扩增反应混合物，其中所述混合物由三个链组成。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的扩增反应混合物，其中所述至少一个双链寡核苷酸添加物由天然核苷酸组成。

11.根据权利要求1-9中任一项所述的扩增反应混合物，其中所述至少一个双链寡核苷酸添加物为DNA。

12.根据权利要求1-3和5-11中任一项所述的扩增反应混合物，其中所述至少一个添加物不是所述至少一个靶序列的引物或探针。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的扩增反应混合物，其中所述至少一个双链寡核苷酸添加物的浓度超过1000nM。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的扩增反应混合物，还包括逆转录酶。

15.根据权利要求1所述的扩增反应混合物，其中所述至少一个双链添加物包括1至4个单链突出端。

16.根据权利要求15所述的扩增反应混合物，其中所述至少一个双链添加物包含至少一个链，所述链在未杂交时，形成茎-环结构。

17.一种用于扩增至少一个DNA靶序列的方法，所述方法包括：使所述至少一个DNA靶序列与根据权利要求1所述的扩增反应混合物接触；和使所述反应混合物经历具有引物退火温度和引物延伸温度的引物依赖性DNA扩增反应。

18.根据权利要求17所述的方法，其中使所述至少一个DNA靶序列与所述反应混合物接触是由加入所述至少一个单链形式的DNA靶序列到所述反应混合物中所组成。

19.根据权利要求17所述的方法，其包括逆转录RNA以获得至少一个DNA靶序列。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一个修饰物为2-4个修饰物。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述双链寡核苷酸具有在引物退火温度到引物退火温度以下不超过5℃的范围内的解链温度Tm。