[发明专利]包含两个选择标记的表达载体系统

说明书

发明领域

本发明涉及适用于选择表达目的产物的宿主细胞，特别是哺乳动物宿主细胞的新选择系统。所述选择系统基于使用至少两种选择标记(sm I和sm II)，其中选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记影响。本发明提供了合适的表达载体、宿主细胞以及用于选择以高产率表达目的产物的宿主细胞的方法。此外，本发明涉及以高产率有效地产生多肽的方法。

发明背景

大量地克隆和表达目的产物例如重组肽和蛋白质的能力变得越来越重要。纯化高水平的蛋白质的能力在人类制药和生物技术领域中是重要的，例如用于产生蛋白质药物，以及在基础研究背景中，例如用于结晶蛋白质，以允许测定它们的三维结构。用其他方法很难大量获得的蛋白质可以在宿主细胞中过量表达并随后进行分离和纯化。

用于产生重组蛋白质的表达系统的选择取决于多种因素，包括细胞生长特性、表达水平、胞内和胞外表达、目的蛋白质的翻译后修饰和生物学活性，以及在生产治疗性蛋白质中的监管问题和经济考虑。哺乳动物细胞优于其他表达系统例如细菌或酵母的主要优点是实现正确的蛋白质折叠、复杂的N联糖基化和真正的O联糖基化、以及广谱的其他翻译后修饰的能力。由于所述优点，真核细胞且特别是哺乳动物细胞是目前选择用于产生复杂的治疗性蛋白质例如单克隆抗体的表达系统。

获得高表达宿主细胞(也称为高生产者)的最常见方法以产生用于表达目的产物的合适表达载体作为第一步。该表达载体驱动编码目的产物的多核苷酸在宿主细胞中表达，并提供至少一种用于产生重组细胞系的选择标记。哺乳动物表达载体的主要元件通常包括能增强转录活性的组成型或诱导型启动子；通常包括Kozak序列的优化的mRNA加工和翻译信号、翻译终止密码子、mRNA切割和多腺苷酸化信号、转录终止子以及用于制备稳定细胞系和用于基因扩增的选择标记；此外，表达载体还可以提供用于细菌中的载体增殖的原核复制起点和选择标记。

近年来，研发的焦点集中于用于在宿主中且特别是在哺乳动物细胞中基因表达的改良载体的设计。尽管有许多可用的载体，但以高产率在哺乳动物细胞中增强地产生多肽/蛋白质仍具有挑战性。

一种已经建立的用于获得以高产率表达目的产物的高产细胞系的方法是宿主细胞的稳定转染。然而，稳定整合到基因组中是偶发事件，并且只有一小部分的稳定转染细胞是高生产者。

为了获得以高产率表达目的产物的宿主细胞，选择标记和选择系统广泛地用于基因工程、重组DNA技术和重组产物的产生中。各个系统还用于产生和鉴定稳定转染的克隆。使用各个选择标记和选择系统的主要目的是引入选择基因，在暴露于选择性生长条件时其允许鉴定能高水平产生重组目的产物的细胞。可以将例如缺乏酶，如二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)的细胞系与含有编码这些选择标记酶的基因的表达载体及试剂例如抑制DHFR的氨甲蝶呤(MTX)和抑制GS的蛋氨酸亚砜酰亚胺(methionine sulfoxamine)(MSX)结合使用，通过基因扩增例如实现增加的产物表达产率。还可以将各个选择标记的更敏感突变形式与野生型细胞结合使用。使用含有在强启动子控制下的重组基因和编码选择标记例如DHFR或GS的基因的表达载体，首先分别获得了DHFR⁺(正)或GS⁺(正)转染子，然后通过在浓度逐渐增加的MTX或MSX中培养转染子来实现基因扩增。提供此种选择性压力的目的是分离表达选择标记并因此以高产率表达目的产物的细胞。

因此，高度严格的选择系统对于从转染的群体中富集高产细胞至关重要。选择系统的严格性越高，选择处理后低生产者的数目越低，并且找到非常稀少的超高产克隆的机会越高。

本发明的目的是提供用于选择以高产率产生目的产物的宿主细胞的严格选择系统，以及合适的表达载体和宿主细胞。

发明概述

本发明涉及用于选择以高产率表达目的产物的宿主细胞的选择系统，并涉及各产物特别是多肽的产生。

根据一个实施方案，本发明涉及表达载体或者至少两个表达载体的组合，其至少包含

(a)编码目的产物的多核苷酸或用于掺入编码目的产物的多核苷酸的插入位点；

(b)编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸；

(c)编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸，所述第二选择标记(sm II)与第一选择标记(sm I)不同，

其中选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响，并且其中选择标记(sm I)和(sm II)都参与叶酸代谢。