[发明专利]包含两个选择标记的表达载体系统

权利要求书

1.表达载体或至少两个表达载体的组合，其至少包含

(a)编码目的产物的多核苷酸或用于掺入编码目的产物的多核苷酸的插入位点；

(b)编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸；

(c)编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸，所述第二选择标记(sm II)与第一选择标记(sm I)不同，

其中所述选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响，且其中所述选择标记(sm I)和(sm II)参与叶酸代谢。

2.根据权利要求1所述的表达载体或至少两个表达载体的组合，其中所述第一选择标记(sm I)是叶酸转运蛋白，并且其中所述第二选择标记(sm II)加工底物，所述底物是叶酸、叶酸的衍生物和/或通过加工叶酸能够获得的产物。

3.根据权利要求1或2所述的表达载体或至少两个表达载体的组合，其中所述第一选择标记(sm I)是叶酸转运蛋白和所述第二选择标记(sm II)是DHFR或者其功能性变体或衍生物。

4.根据权利要求1至3中至少一项所述的表达载体或至少两个表达载体的组合，其中所述第一选择标记(sm I)是维生素Bc受体和所述第二选择标记是DHFR变体，所述DHFR变体比野生型DHFR酶和/或由宿主细胞内源表达的DHFR酶对MTX更不敏感。

5.根据权利要求1至4中至少一项所述的表达载体或至少两个表达载体的组合，其中所述第一选择标记(sm I)是或者包含人叶酸受体或其功能性变体和/或所述第一选择标记是具有或包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.1、2或3的叶酸受体或者前述的功能性变体。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的表达载体或至少两个表达载体的组合，其中所述编码目的产物的多核苷酸包含于表达盒中，所述表达盒至少包含

(a)编码目的产物的多核苷酸，

(b)在编码目的产物的多核苷酸的下游的至少一个终止密码子，和

(c)在终止密码子的下游编码膜锚和/或用于膜锚的信号的多核苷酸。

7.宿主细胞，其至少包含

(a)编码目的产物的引入多核苷酸；

(b)编码第一选择标记(sm I)的引入多核苷酸；

(c)编码第二选择标记(sm II)的引入多核苷酸，所述第二选择标记(sm II)与第一选择标记(sm I)不同，

其中所述选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响，且其中所述选择标记(sm I)和(sm II)参与叶酸代谢。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中已经将根据权利要求1至6中至少一项所述的表达载体或至少两个表达载体的组合引入到所述宿主细胞中。

9.根据权利要求7或8所述的宿主细胞，所述宿主细胞是CHO细胞，优选地DHFR⁺(正)细胞。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是DHFR⁺(正)细胞，并且所述第一选择标记(sm I)是维生素Bc受体和所述第二选择标记(sm II)是DHFR变体，所述DHFR变体比野生型DHFR酶和/或由宿主细胞内源表达的DHFR酶对MTX更不敏感。

11.用于产生根据权利要求7至10中至少一项所述的宿主细胞的方法，其包括至少将以下多核苷酸引入到所述宿主细胞中的步骤

(a)编码目的产物的多核苷酸；

(b)编码第一选择标记(sm I)的多核苷酸；

(c)编码第二选择标记(sm II)的多核苷酸，所述第二选择标记(sm II)与第一选择标记(sm I)不同，

其中所述选择标记(sm I)或(sm II)的活性至少部分地受到另一选择标记的活性影响，且其中所述选择标记(sm I)和(sm II)参与叶酸代谢。

12.根据权利要求11所述的方法，其中将根据权利要求1至6中至少一项所述的表达载体或表达载体的组合引入到宿主细胞中。