[发明专利]产生和筛选DNA编码的库的方法

说明书

背景技术

药物开发的迅速增长的成本已导致持续探索尽可能廉价地筛选更大化学空间的新方法以发现具有更高效能以及很少毒性至没有毒性的分子。在二十世纪八十年代组合化学方式最初被誉为是超越药物开发范式的方法，但在很大程度上是失败的，这是由于库大小不足以及不适当的去卷积方法。最近，小分子的DNA显示组合库的使用已产生用于筛选治疗性前导化合物的新范式转变。

Morgan等人(美国专利申请公开号2007/0224607，以引用方式结合于本文)确定了在药物开发中使用DNA-显示组合方式的主要挑战：(1)足够复杂性的库的合成以及(2)在所使用的筛选中具有活性的分子的鉴定。另外，Morgan等人说明了，库的复杂性程度越高，即，存在于库中的不同结构的数目越高，则库包含具有感兴趣活性的分子的可能性就越大。因此，在库合成中采用的化学性能必须能够在合理的时间框架内产生大量化合物。在识别具有不同化学型和高亲和力的分子时，这种方式通常是成功的。然而，关于产生巨大复杂性的库以及在已描述的规模上评估测序输出，则已显露许多问题。例如，在多重化学转化(例如，通常为3个或4个步骤)和生物转化(例如，DNA标记的酶促连接)以后库的纯化是麻烦的并且导致在库中的大量的“噪声”，这是由于分子的不完全合成或由于在连接步骤期间的错标记。此外，为查询所选择群体所需要的测序量是惊人的，通常需要“下一代”测序方法。后者是由于以下事实：需要嵌入库的DNA部分中的复杂的遗传标记方案、以及用于分析“下一代”测序输出的生物信息学算法以通过噪声筛选和确定库中的击中(采样，hits)。因此，甚至使用这些方法，仍然没有足够推进测序以从给定筛选中完全捕获序列的多样性(表示真正击中和“噪声”两者)。

组合小分子库的DNA显示依赖于库的多步的、分离-和-合并合成，其结合(偶联，偶合)于DNA标记的酶加成，其中上述DNA标记编码所使用的合成步骤和结构单元(标准部件，building block)。通常进行和编码许多(例如，3个或4个)合成步骤，并且这些合成步骤包括多样性位置(本文描述为A、B、以及C(图1))，如那些通过将具有例如胺或羧酸酯官能团的结构单元结合到化学骨架上所形成的多样性位置，其中化学骨架显示在限定方向上的连接的结构单元。经常用于组合库中的骨架(S)的一个实例是三嗪部分，其可以在它的环状结构周围的三个位置中正交衍生。

库形成过程可以是费时的，产物经常被未有效纯化，以及结果是可以发生未知反应，其会产生连接于DNA的不想要的和/或未知的分子。此外，库的不完全纯化可以导致在连接步骤期间的标记交叉污染，从而导致错标记。用于从库中筛选和测序击中的最终结果是，必须采用大规模并行测序，这是由于连接于意外的分子(例如，未反应的或副产物)的DNA或错标记的DNA固有的“噪声”。因此，会损失测序的效率。

在一些情况下，从其构建小分子库的起始寡核苷酸(initiator oligonucleotide)，包含以共价封闭、双链寡核苷酸形式的用于聚合酶扩增(例如，PCR)的引物结合区。对于进行聚合酶反应来说，这种构建物是很成问题的，这是由于难以解链双链体以及难以使引物寡核苷酸结合和引发聚合作用，其导致无效反应，从而降低产率10至1000倍或更大。

需要更多分步方式以筛选和识别具有更高效能以及很少毒性至没有毒性的小分子。

发明内容

本发明的特征在于一种用于产生和筛选简化的DNA编码库的方法，由于更少合成步骤(例如，没有酶促连接或没有共价封闭的起始双链寡核苷酸)，因此，在编码低聚物(此处被称为“标识区”)的分析期间，显著更少的“噪声”。因此，考虑到可以混淆数据的解释的固有偏误，其中数据可以通过编码区的扩增来引入，测序变得更加有效，或可替换地，微阵列分析变得可能。我们还已确定了用于产生更多化学反应多样性而不是那些简单限于含水条件的化学反应的方法以使得DNA编码的库更加疏水的和可溶于用于随后库合成步骤的有机溶剂中。以这种方式，可以用潜在更高的产率、更多结构单元多样性来进行化学反应，并改善化学反应的保真度。