[发明专利]一种细胞冻存液及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及组织细胞培养技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

细胞冻存液是细胞冻存时必须的一种溶液，长期以来大量国内外生物细胞学术相关书籍介绍的常规冻存液配方和我们长期所使用的冻存液各组分体积百分比均为：细胞培养液70～80％，牛血清10～30％，二甲基亚砜10％。常规使用的培养液如MEM、M199、Eagle和DMEM等均已市场商品化。

冻存液的作用是使细胞均匀地分散在溶液中，给细胞一个均匀分布的环境和空间，同时供给细胞生命代谢所必须的营养物质，防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤。在长期的生物学实验中，广泛使用上述配方冻存细胞。

大量的实际生物细胞学实验和大量统计数据表明，采用这种冻存液所冻存的细胞复苏后存活率一般在50～70％，成活率比较低。冻存细胞经过复苏，培养12小时后在普通光学显微镜下观察，存活率一般在60％左右；当存活率小于50％时，细胞生长繁殖缓慢，形态不规则，细胞比较细小，长势比较差，基本上不能存活；当细胞存活率在60％左右时，细胞分布比较均匀，活细胞比较多，形态比较正常，长满单层需要6～8天。

目前采用的细胞冻存液的冻存过程与复苏效果：

常规细胞冻存液包括以下体积百分比的各组分：

细胞培养液      70％，

小牛血清        20％，

二甲基亚砜      10％。

以上各组分混匀即成。

细胞冻存过程：培养生长成单层的VERO、BHK-21、MRC-5、2BS或KMB17细胞一瓶，其细胞密度约6×10⁴/cm²、培养面积为225cm²，0.25％的胰酶消化2分钟，弃掉胰酶，加入培养液10ml，吹打混匀细胞悬液，离心1500转/10分钟，弃上清，加入常规的冻存液20ml混匀，2ml/管分装入洁净的冻存管；将该冻存管置于2～8℃2小时，-20℃2小时，-80℃过夜，然后浸入液氮中长期保存。

细胞复苏过程：从液氮中取出冻存的VERO、BHK-21、MRC-5、2BS或KMB17细胞一管(2ml/管)，置入37℃水浴溶解，离心1500转/10分钟，弃掉上清，加入20％小牛血清培养液10ml，置37℃培养；培养12小时候后观察，可见有60％左右的细胞贴壁；未长成单层细胞，更换10％的小牛血清培养液继续培养，6～8长满单层细胞后传代培养。

在生物技术飞速发展的今天，人们在生物技术学及其相关科学的研究中，越来越多的运用组织细胞培养繁殖技术，将有研究意义或有应用前景的组织细胞采用低温度进行长期的保存，一旦有需要，可以随时对所的细胞进行复苏，恢复其完整的形态结构与生物学特征，供生命科学研究使用，细胞冻存和复苏的效果是直接影响细胞增殖成功与否的的关键技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞冻存液及其制备方法和应用。

本发明提供的细胞冻存液，包括下述体积百分比的各组分：

细胞培养液              5～20％，

小牛血清                65～80％，

二甲基亚砜              10％，

3％(w/v)谷氨酰胺溶液    1～3％，

7.5％(w/v)碳酸氢钠溶液  2～4％。

本发明提供的细胞冻存液，优选包括下述体积百分比的各组分：

细胞培养液              10～15％，

小牛血清                70～75％，

二甲基亚砜              10％，

3％(w/v)谷氨酰胺溶液    2％，

7.5％(w/v)碳酸氢钠溶液  3％。

其中，所述的细胞培养液可任意选用MEM、M199、Eagle或DMEMD。

本发明还提供所述细胞冻存液的制备方法，包括混合所述配方比例的细胞培养液、小牛血清、二甲基亚砜、3％(w/v)谷氨酰胺溶液和7.5％(w/v)碳酸氢钠溶液。

本发明所提供的细胞冻存液可应用于细胞冻存，可提高冻存细胞复苏培养后的存活率。

本发明的优点：

与现有技术相比，本发明在常规细胞冻存液组分基础上增加了3％(w/v)谷氨酰胺溶液，还增加了7.5％(w/v)碳酸氢钠溶液，同时调整了细胞培养液和小牛血清的含量。