[发明专利]一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种制备甲型肝炎灭活疫苗的新方法。

背景技术

甲型肝炎，简称甲肝，是由甲型肝炎病毒引起的一种严重危害人类健康的急性传染病。甲肝主要通过“粪-口”途径传播，或个人间的传播，或因污染了甲肝病毒的水或者食物从而引起甲肝爆发。大龄儿童和成人感染甲肝后，70％以上为临床型感染，病死率为0.3％～0.6％；50岁以上患者的病死率为1.8％；慢性肝病者感染甲肝后，发生急性肝衰竭的危险性升高。随着生活条件的改善，成年人感染甲肝人数有增多趋势，临床型甲肝比例上升，从而甲肝成为较严重的公共卫生问题。

我国是甲型肝炎高发区，每年至少有24万人患甲型肝炎，造成巨大的经济损失和社会危害，接种甲型肝炎疫苗是预防甲型肝炎流行的最有效措施。

目前世界上有两种预防控制甲肝的疫苗，一种是甲肝减毒活疫苗，甲肝减毒活疫苗如L-A-1株已用于规模生产近20年，在预防控制甲肝的爆发和流行、降低发病率方面起到了巨大作用，但减毒活疫苗存在毒力返祖，对一些免疫缺陷个体可能诱发严重疾病等缺点；另一种是甲肝灭活疫苗，甲肝灭活疫苗具有安全性好、免疫后抗体水平高、效期长、稳定性好的优点。

目前国内生产的甲型肝炎灭活疫苗，由于各生产厂家使用的毒株、细胞基质和生产工艺不同，产品质量参差不齐。我国人口众多，甲肝疫苗远不能满足国内市场需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备甲型肝炎灭活疫苗的新方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其是将甲肝病毒与人胚肺二倍体细胞MRC-5混合吸附后接种到细胞工厂增殖甲肝病毒，至病毒增殖高峰期，用胰酶消化细胞，收获细胞病毒液，经超声破碎，氯仿抽提，超滤膜超滤，去除细胞杂蛋白，然后经过凝胶过滤层析纯化，除菌过滤，氢氧化铝佐剂吸附，制成甲型肝炎灭活疫苗。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

本发明的一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，包括如下步骤：

1)按常规方法培养人胚肺二倍体细胞MRC-5，长成单层后将细胞基质用胰酶消化分散为单个细胞，加入含10％小牛血清的MEM细胞培养液使细胞浓度为每毫升含100-150万个细胞，细胞液按0.05-0.1MOI加入甲肝病毒，在20-30℃温度下进行混合吸附30-90分钟；

其中，所述MEM为0.03％Glu、0.08％NaHCO₃、0.01％青霉素和0.01％链霉素。

2)将混合吸附的细胞-病毒混合液用含10v/v％小牛血清的MEM细胞培养液稀释10倍后按0.5MOI接种于2-40层细胞工厂增殖甲肝病毒；培养温度为34-35℃，培养时间为21-24天。

3)病毒增殖高峰期，用0.125w/v％胰酶常规消化细胞，以每平方厘米面积加入20μl 0.01M pH值7.2的PBS收集细胞病毒混合液。

4)超声破碎细胞病毒混合液，超声破碎的输出功率为1500W，每次在冰浴中超声5分钟破碎细胞，共超声4～6次，使破碎率达98％以上。

5)离心步骤4)得到的混合液，取上清加入氯仿抽提，离心后取上层水相，得到粗制甲肝病毒液。其中，抽提为按三氯甲烷与病毒液1∶2的体积比混合，振摇20分钟，以每分钟4500转的速度离心20分钟，吸取上层水相。蛋白相再用抽提缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)抽提4次，抽提4次即能将大部分病毒回收，合并上层水相。

6)将步骤5)制得的粗制甲肝病毒液经超滤膜超滤浓缩，所用超滤膜的分子量为50-100KD。

7)浓缩的病毒液经凝胶层析纯化后，经0.2μm滤膜除菌过滤，滤液用甲醛灭活。其中，凝胶层析所用层析柱为Phenyl Sepharose 6FF。

8)灭活后的病毒液经氢氧化铝佐剂吸附，制成甲型肝炎灭活疫苗。

前述的方法，其中所用甲肝病毒毒种为甲肝病毒株SH，该毒株分离自甲型肝炎急性期患者粪便，经MRC-5细胞适应，命名为SH毒株，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCCNO.4501，保藏日期2010年12月21日。

优选地，步骤1)所述的混合吸附为将长成单层的二倍体细胞弃去细胞生长液，用0.01mol/L PBS(pH6.8)洗细胞面3次，加入0.125w/v％胰酶-EDTA消化细胞，加入MEM细胞培养液使细胞浓度为每毫升含100-150万个细胞，细胞液按0.05-0.1MOI加入甲肝病毒在20-30℃温度下进行混合吸附30-90分钟。