[发明专利]一种液滴阵列PCR芯片及其应用

说明书

一、技术领域：

本发明涉及一种实时定量PCR芯片及其荧光检测系统，特别是涉及一种基于液滴阵列的PCR芯片和荧光成像检测系统。

二、背景技术：

实时定量(反转录)聚合酶链式反应(以下简称qPCR或qRT-PCR)技术是以传统PCR技术为基础建立起来的一种可对原始核酸(包括DNA和RNA)模板拷贝数进行准确定量分析的一种现代分子生物学检测技术。由于qPCR技术具有准确度高，线性范围宽等优势，因此，已经广泛地用于分子诊断，疾病研究，临床医学等领域。qPCR技术通常遵循传统PCR的扩增原理，不同的是在每一个循环的退火或延伸阶段进行实时定量检测，而溶液中模板的原始拷贝数的对数与检测阈值(Ct)存在线性关系。

在过去的十几年间，传统仪器的微型化和便携化已经成为生物、化学及医药行业的一个重要的发展方向，其中，微型化的传统PCR装置已经成为研究的热点之一，尤其是微型化的qPCR技术由于其具有低成本，高灵敏度和高通量的，有希望成为大规模基因表达分析和药物筛选领域的重要工具平台而逐渐成为研究者关注的焦点。最近，Hua等[Zhishan Hua，Jeremy L.Rouse，Allen E.Eckhardt，VijaySrinivasan，Vamsee K.Pamula，Wiley A.Schell，Jonathan L.Benton，Thomas G.Mitchell，§and Michael G.Pollack，Multiplexed Real-Time Polymerase ChainReaction on a Digital Microfluidic Platform Anal.Chem.2010，82，2310-2316]提出了一种基于电润湿驱动的数字微流控qPCR系统，包裹着不同模板分子的液滴在四个平行环形通道中分别经过不同温区，进行扩增和检测。该系统的缺点是通量太低，而且每条环形通道都必须配备一套荧光检测系统，过于复杂。

国外一些公司也开发了一些微型化PCR产品，例如，STMicroelectronics的In-Check^TM系统和美国佳能生命科学的数字多重PCR芯片[I.T.奈特，井上裕司，用于数字多重PCR测定的装置和方法，公开号CN 101583724A，]。两种产品都是基于微流控芯片技术，In-Check^TM芯片是在进行PCR扩增后，将产物与微阵列芯片进行杂交反应，采用端点检测技术对基因表达进行分析的一种技术。而后者是将芯片得到的PCR产物做溶解度曲线分析，通过荧光强度不同输出0或1信号作为阴性或阳性的阈值，进行SNP分析。另一些公司很早就将研究重点放在了qPCR技术上，其中，比较典型的例子是美国ABI公司的芯片和Fluidigm的BioMark^TM微流控数字PCR芯片系统。芯片是在不锈钢材料上加工出三千个纳升级孔阵列，并采用化学修饰技术将孔内外表面进行不同处理，以每个纳米孔位基本单位，进行平行qPCR检测分析。该芯片的缺点是加工工艺比较复杂，成本较高。而BioMark^TM数字微流控芯片采用的材料是价格便宜的聚二甲基硅氧烷(PDMS)，采用软刻蚀技术在芯片上加工了几千个微泵阀结构，可以实现自动化添加样品和试剂功能，样品通量最高达到487700。

事实上液滴阵列也是一种非常适合进行微型化qPCR分析的技术，美国TTPLabTech公司开发了一套纳升级液滴阵列生成装置，用于高通量蛋白结晶筛选。但是，该系统并没有被用于qPCR系统，可能由于在液滴生成过程中不可避免地会伴随水分蒸发以及PCR热循环过程中极易导致液滴之间相互融合易位等问题。然而，液滴阵列技术无论从成本，芯片设计，还是操作的容易程度等方面都是一种理想的用于微型化qPCR分析的平台和技术。

三、发明内容

本发明提供了一种可实时定量进行PCR检测的反应芯片，以及包括芯片的荧光检测系统。

本发明采用的技术方案是：

一种液滴阵列PCR芯片，所述芯片是以单晶硅片或玻璃片为基材，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到，所述的芯片以单晶硅片或玻璃片为基材、在所述的基材上依次附着SiO₂氧化层、由SiO₂氧化层表面硅烷化生成的硅烷层，所述的硅烷层布置有光刻胶工艺刻蚀形成的可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，所述微型亲水阵列外围设置有封闭成环的护栏，所述的护栏与所述硅烷层液密封连接。