[发明专利]一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物及其制备方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是奶牛乳房炎和医源性感染的主要病原之一。目前的研究表明，金黄色葡萄球菌有11个血清型，临床病例分离的金黄色葡萄球菌多为荚膜多糖5型（type 5 capsular polysaccharide，CP5）、荚膜多糖8型（type 8 capsular polysaccharide，CP8）和无荚膜的336型（type 336 polysaccharides，336PS），且不同国家和地区主要流行血清型不同。Verdier I（2007年）对195株医源性金黄色葡萄球菌的分型结果表明，CP5型占42%，CP8型占45%，336型占13%。Melles D C（2008年）等对丹麦分离的162株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌的分型结果表明，CP5型占28.4%，CP8型占53.7%，336型占17.9%。韩国学者Han H R等（2000年）对该国奶牛乳房炎分离的107株金黄色葡萄球菌进行血清型分型发现，无荚膜的336PS型占46.7%，CP5和CP8均阳性的菌株为12.1%，CP5/336均阳性菌株为17.8%，CP5/336均阳性菌株为6.5%，未能分型的菌株为4.7%。王登峰等（2010年）对新疆不同地区5个大型奶牛场分离的117株金黄色葡萄球菌分型表明，CP5型占10.36%，CP8型占13.68%，无荚膜的336型占64.96%，未能分型菌株占11.11%。

目前对金黄色葡萄球菌的感染主要使用抗生素进行治疗，但由于该菌容易对抗生素产生抗性，导致其耐药性增强，治疗效率下降。通过免疫预防进行该病防制已成为研究的热点。但是，由于金黄色葡萄球菌荚膜多糖（CP5、CP8）和胞外多糖(336PS)无免疫原性，直接使用相应的提取物作抗原不能够刺激机体产生免疫保护。将其分离、纯化并与合适的蛋白偶联，可作为抗原制备疫苗，刺激机体产生免疫保护。

荚膜多糖CP5、CP8的纯化和偶联研究较多，但无荚膜型的金黄色葡萄球菌胞外多糖的化学结构与荚膜多糖CP5、CP8完全不同，其纯化和偶联方法也有所差异。建立一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖的纯化和偶联技术方法，将为预防该型金黄色葡萄球菌疫苗的研制提供技术支撑。

胞外多糖是金黄色葡萄球菌的主要抗原成分和毒力因子，它具有抗吞噬活性，能阻止中性粒细胞对细菌的吞噬和与相关抗体的结合。有关研究表明，金黄色葡萄球菌胞外多糖的结构为聚磷酸化核糖醇-N-乙酰葡萄糖胺，与革兰氏阳性球菌细胞的主要成分壁磷壁酸类似。该多糖分子量小，免疫原较差，经过纯化并与合适的载体蛋白偶联能够提高荚膜多糖免疫原性。目前国外已公开的无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖纯化和偶联方法主要采用是Ali Ibrahim Fattom（专利文献号US005770208A，US002194151B1；论文：INFECTION AND IMMUNITY，Vol.60，No.2，p.584-589）的方法。具体方法为：培养无荚膜型金黄色葡萄球菌至吸光度值20.0（650nm），然后用苯酚-乙醇溶液（体积比1:1）低温处理2小时灭活菌体，离心收集沉淀-70℃冻存。悬浮菌体至0.5g/mL，加入溶葡萄球菌酶至终浓度100～150μg/mL，37℃处理3小时，在加入DNA酶、RNA酶至终浓度50μg/mL，培养4小时，然后用25%～75%梯度乙醇浓度沉淀多糖。75%乙醇离心收集沉淀，透析冻干。选择Q Sepharose柱离子交换层析后，将收集的多糖再经溶菌酶的消化残余的糖肽，再经凝胶过滤层析即得到纯化多糖。偶联试剂选择的是ADH和EDAC，但反应介质是在水。用该方法进行纯化和偶联时，纯化过程较为繁杂，偶联反应体系不稳定，不易批量化制备。

发明内容

本发明的目的是：制备一种可为人类或其它动物无荚膜型金黄色葡萄球菌感染疫苗研制提供保护性抗原的技术方法，利用化学手段制备无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖与蛋白质的偶联物。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：所述无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物由无荚膜型金黄色葡萄球菌的胞外多糖在偶联试剂作用下与蛋白质共价偶联制备而成的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物。

所述偶联试剂是EDAC和Sulfo-NHS或EDAC和ADH。

所述蛋白质为牛血清蛋白或卵清蛋白或人血清蛋白或白喉毒素。