[发明专利]一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物及其制备方法

权利要求书

1.一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物，其特征在于：所述的多糖-蛋白质偶联物由无荚膜型金黄色葡萄球菌的胞外多糖在偶联试剂作用下与蛋白质共价偶联制备而成的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物。

2.根据权利要求1所述的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌-蛋白质偶联物，其特征在于：所述偶联试剂是EDAC和Sulfo-NHS或EDAC和ADH。

3.根据权利要求1所述的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌-蛋白质偶联物，其特征在于：所述蛋白质为牛血清蛋白或卵清蛋白或人血清蛋白或白喉毒素。

4.根据权利要求1所述的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物的制备方法，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：

（1）无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖的纯化；

（2）用pH值为4.7的100mmol/L MES缓冲液将纯化后的多糖配成10mg/mL的溶液，取1.0mL液体与400μL EDAC(10mg/mL)和88μL Sulfo-NHS(6.25mg/mL)溶液混合反应4～6小时后，将反应物在pH值为7.5的1mmol/L EDTA的0.1mol/L PBS缓冲液中4℃条件下透析18小时，收集衍生化的多糖中间体溶液；

（3）向衍生化的多糖中间体溶液中加入蛋白质10mg，同时再加入200μL EDAC(10mg/mL)和44μL Sulfo-NHS(6.25mg/mL)溶液进行反应12小时，形成多糖-蛋白质偶联物溶液；

（4）通过凝胶过滤层析法对多糖-蛋白质偶联物进行纯化并收集波峰部分溶液。

5.根据权利要求1所述的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物的制备方法，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：

（1）无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖的纯化；

（2）用pH值为5.6的100mmol/L MES缓冲液中将纯化后的多糖配成10mg/mL的溶液，取1.0mL溶液，加入ADH和EDAC至0.36mol/L、0.015mol/L，反应4～6小时用透析袋（分子截留量为15KDa）4℃透析，去除EDAC和ADH，收集衍生化的多糖中间体溶液；

（3）向衍生化的多糖中间体溶液中加入蛋白质10mg，同时再加入200μL EDAC(10mg/mL)溶液进行反应18小时，收集多糖-蛋白质偶联物溶液；

（4）通过凝胶过滤层析法对多糖-蛋白质偶联物溶液进行层析并收集波峰部分溶液。

6.根据权利要求4或5所述的一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物的制备方法，其特征在于：所述的无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖的纯化包括以下步骤：

（1）将无荚膜型金黄色葡萄球菌菌株接种在含有2%氯化钠的哥伦比亚液体培养基中，37℃ 170转/分钟在振荡培养箱中培养22～24小时，5000转/分钟离心收集菌体沉淀；

（2）菌体沉淀用pH值为7.5含2mmol/L硫酸镁的50mmol/LTris缓冲液悬浮至0.25g/mL加入溶葡萄球菌素至浓度200μg/mL，37℃孵育4小时，12000转/分钟离心30分钟收集上清液；

（3）将上清液用聚乙二醇浓缩至体积的1/5，收集多糖浓缩液；

（4）在多糖浓缩液中加入无水乙醇至总体积的25%～30%，混匀后静置30分钟，12000转/分钟离心30分钟后收集上清液；

（5）向上清液中再次加入无水乙醇至总体积的75%，混匀静置30分钟后离心12000转/分钟收集沉淀，室温下放置挥发多余的乙醇，留取粗多糖沉淀物；

（6）将粗多糖沉淀物以10mg/mL溶解于缓冲液中，加入DNA酶和RNA酶至浓度0.1mg/mL，37℃振荡培养箱温育6小时，再加入蛋白酶ⅩⅣ消化，再次用无水乙醇浸提，获得粗多糖；

（7）将粗多糖用去离子水溶解，在去离子水中透析48小时；

（8）采用凝胶过滤层析法对粗多糖进行纯化，用可见-紫外分光光度计检测吸光度值（206nm），并绘制曲线，收集波峰部分的液体组分，冻干后获得纯化的无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖。