[发明专利]快速检测人肠道病毒71型的荧光定量PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种引起人类多种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种快速检测人肠道病毒71型荧光定量PCR试剂盒，适用于人肠道病毒71型的定性定量检测。

背景技术

人肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)，同一属的病毒还有脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒等。这类病毒通过在人体的消化道组织中侵袭与繁殖后经过血液循环传播，而最终导致多种临床病征。EV71最初于1969年由Schmidt等从美国加利福尼亚州1名9个月大的脑炎患儿的脑脊液中分离出，1972年定出血清型，并于1974年首次报道。自报道以来，该病毒在世界范围内引起十多次爆发与流行，因而受到了人们的广泛关注。EV71感染多呈隐性，显性表现轻微者可导致手足口病、腹泻、皮疹、无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎，严重者可表现为急性弛缓性瘫痪、全脑炎、肺水肿或出血等，最终可导致死亡。

因此，准确及时地诊断EV71对指导临床治疗、评估疾病的发展和预后具有重大意义。

近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Eng Lee Tan，Li Li Gaynor Yong，Rapid detection of Enterovirus 71 by real-time TaqManRT-PCR[J].Journal of Clinical Virology 42(2008)203-206；)和定量检测(Singh S，Chow VTK，Phoon MC，Chan KP，Poh CL(2002)Direct detection of enterovirus 71(EV71)in clinical specimens from a hand，foot and mouth disease outbreak in Singapore by reverse transcription-PCR with universal enterovirus and EV71-specific primers.J Clin Microbiol 40：2823-2827；Tan EL，Chow VTK，Kumarasinghe G，Lin RTP，Mackay IM，Sloots TP，Poh CL(2006)Specific detection of Enterovirus 71 directly from clinical specimens using real-time RT-PCR hybridization probe assay.Mol Cell Probes 20：135-140.)等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量的主要方法，国内目前已有关于丙肝、乙肝、淋球菌、支原体、衣原体、艾滋病和结核定量检测的试剂盒上市。

临床检测上传统的培养法和血清学方法具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点；常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题；因此焏待开发一种精确、灵敏、快速和无污染的临床检验方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速检测人肠道病毒71型的荧光定量PCR试剂盒。

本发明采用以下技术方案：

一、PCR试剂盒

该试剂盒包括：RNA提取液(即TRIZOL核酸抽提试剂)、荧光定量PCR反应液、EV71标准阳性模板PMD18-T-EV71和阴性质控标准品；

1、荧光定量PCR反应液含有人肠道病毒71型特异性引物对和荧光探针，

1)人肠道病毒71型(EV71)：

正向引物为5′-GCCCAATYACAGCCTATYATAATAGC-3′，

反向引物为5′-TACARTCTGCCYACCCTARTCTC-3′，其中正向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，反向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基；

2)荧光探针序列为5′-CTAGCGGCAGCCCAAA-3′，该荧光探针序列可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，荧光探针5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记Eclipse，可以大大减少背景噪音的干扰。