[发明专利]导电微粒子介导电化学发光信号的免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及电化学发光免疫检测技术领域，是一种导电微粒子介导电化学发光信号的免疫检测方法。

背景技术

目前在生物化学和生物物质中，对于痕量待测物包括环境污染物、药物、激素、抗体、核酸等的高灵敏度定量筛选和检测已经成为广大研究工作者和临床工作者关注的焦点之一。为了实现痕量待测物的高特异性检测，各种基于生物特异性反应如抗原-抗体技术、核酸杂交技术、蛋白-配体技术等不同生物化学方法和体系日益发展起来，这种体系可以通过在生物分子上标记不同标记物进行定量检测。例如，最初使用¹²⁵I作为标记物，通过放射性信号测量进行检测定量。这些方法精密度高，测定可靠，但由于放射性元素的使用，需要建立特殊的实验室，否则对人体会造成很大的伤害。另外，¹²⁵I有一定的半衰期。为了克服这些缺点，后来发展了使用荧光物质如FITC等作为标记物，采用生物荧光的方法进行检测。但其灵敏度受到了限制。后来在20世纪90年代，Leland等人建立了电化学发光反应系统之后，以电子得失过程中的电位差做能量激发源的电化学发光分析相应建立。

电化学发光(ECL)是指由电化学反应引起的化学发光过程。在电极上施加一定的电压或电流时，电极上发生电化学反应，在电极反应产物之间、或电极反应产物与溶液中某种组分之间发生化学反应而产生激发态，当激发态返回到基态时产生发光现象。电化学发光的现象很早就被发现，运用电化学发光进行检测分析的文献报道直至80年代初才出现，90年代开始用于试剂的临床检测中。从整体上讲，电化学发光包括了电化学和化学发光两个过程，故是化学发光的一种发展，但同时与化学发光又有一定的区别和其独特的优势：一般的化学发光生物分析的标记物是化学发光反应催化酶(如过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或化学发光分子(如鲁米诺、吖啶酯等)，其发光强度受周围环境的影响较大，而且稳定性不高，特别是生物酶。另外，在生物特异性检测时，必须分离游离和结合相，操作步骤较多。而电化学发光免疫分析一般采用联吡啶钌Ru(bpy)₃²⁺为标记物，Ru(bpy)₃²⁺在三丙胺阳离子自由基(TPA^+·)的催化及三角形脉冲电压激发下，只需毫秒内就可发出稳定的光。Ru(bpy)₃²⁺在发光过程中的再循环利用大大提高了分析的灵敏度；无需将结合相和游离相分开，从而使检测步骤大大简化；小分子的金属配合物作为标记物，稳定性高。因此，电化学发光生物分析有其突出的优点：标记物稳定，灵敏度高，可实现多元检测，可实现均相免疫分析，可实现全自动化。ECL具有更好的发展趋势。

目前报道的电化学发光生物分析方法，主要是将生物分子通过各种不同的技术固定在具有较高电化学发光活性的金、铂金等金属电极或碳、玻碳等非金属电极表面，然后通过特异性结合反应，实现对待测物的电化学发光检测。但是，由于用于电化学发光检测的共反应物TPA在上述电极上都能产生少量的发光，采用这种技术具有无法克服的背景光，因而仍然无法满足痕量物质的检测要求。

发明内容

本发明的目的是公开一种导电微粒子介导电化学发光信号的免疫检测方法，通过克服现有技术中的背景发光问题，建立一种可以实现高灵敏度检测的新型电化学发光免疫分析方法，该方法背景低、信噪比高，可满足痕量物质的检测要求。

为达到上述目的，本发明的技术解决方案是：

一种导电微粒子介导电化学发光信号的检测方法，其利用具有生物特异性结合反应性能的导电微粒子介导电化学发光信号；包括步骤：

a)以一种具有电化学发光活性的导电材料制成微粒子，在微粒子表面固定针对待测物的抗体分子；

b)在一个非电化学发光活性的电极上，固定能与a)步中抗体分子形成二元免疫复合物的抗原分子，或固定能与a)步中抗体分子和待测物形成三元夹心免疫复合物的抗体分子；

c)加入待测物后，微粒子通过特异性的免疫结合反应，在电极表面形成抗原-抗体免疫复合物；

d)在有电化学发光物质和共反应物存在时，向上述电极施加电压，在微粒子表面产生电化学发光信号，进而对待测物进行定量测量。

所述的电化学发光信号的检测方法，其所述微粒子的尺寸是微米级或纳米级；微粒子的形状是圆形、椭圆形或棒状。

所述的电化学发光信号的检测方法，其所述具有电化学发光活性的导电材料，为金、铂金材料，或碳材料。