[发明专利]蓝耳病RT-LAMP检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种蓝耳病RT-LAMP检测方法及检测试剂盒。

背景技术

猪蓝耳病主要是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV)感染引起的疾病，1990～1991年蓝耳病在欧洲爆发，引起超过100万头猪死亡，1991年荷兰人Wenswort等首次从病猪体内分离出该病毒。蓝耳病猪死亡率一般为50%，甚至90%～95%，主要引起妊娠母猪流产、早产、死产和木乃伊胎，而仔猪主要有咳嗽、呼吸困难等症状。蓝耳病是OIE规定的B类动物传染病，集约化养殖场一旦感染，难以净化，自美国1987年首次报道以来, 蓝耳病已蔓延到全球，每年都造成巨大的经济损失，对世界各国的养猪业构成了严重的威胁，快速、特异、敏感的检测PRRSV对养猪业有效控制PRRSV具着重要的意义。

国内外学者已经建立了多种检测蓝耳病的方法。间接免疫荧光试验、免疫过氧化物酶单层试验等免疫学检测方法，检疫周期长、操作繁琐、确诊困难，因而不利于准确、快速、高效的监控PRRSV的疫情。随着现代分子生物学的发展，已有多种分子诊断技术应用于蓝耳病的检测，如RT - PCR、基因芯片技术、核酸序列依赖性扩增（NASBA ）、实时荧光RT-PCR、错配扩增突变试验（MAMA）等，但这些方法均需要昂贵的专用仪器和试剂，不适合在基层实验室推广应用，而新型核酸扩增技术——环介导等温扩增（LAMP）与其它检测方法相比，具有简便、快速、特异等优势，不需PCR仪，在水浴锅中即可完成扩增，特别适合于基层实验室推广使用。目前来说还没有建立了一种方便在野外及基层实验室进行蓝耳病检测的简便、快速、特异的RT-PCR检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种简便、快速、特异的蓝耳病RT-PCR检测方法及检测试剂盒。

本发明所采用的技术方案是：本发明涉及的蓝耳病RT-LAMP检测方法，包括以下步骤：

A：取待检样品提取核酸，进行反转录以得到cDNA；

B：以所述cDNA为模板，用外引物（B3、F3）和内引物（FIP、BIP）在反应体系中进行恒温扩增；所述外引物（B3、F3）和内引物（FIP、BIP）的序列分别如下：

B3：5’-ATGCTGAGGGTGATGCTGT-3’

F3：5’-CATTTCCCTCTAGCGACTGA-3’

FIP：5’-GCCCTGATTGAAGGCAGTCTGGACTTTACCCCTAGTGAGCGG-3’

BIP：5’-ACCCTGTCAGATTCAGGGAGGATCAGACGCACAGTATGTTGC-3’；

C：在扩增产物中加入显色剂根据颜色变化来判定结果；或者取扩增产物用琼脂糖电泳检测方法来判定结果。

经过优化设计，所述反应体系中的外引物（B3、F3）的浓度均为10μM，内引物（FIP、BIP）的浓度均为80μM。

经过优化设计，在步骤B中恒温扩增的反应条件为：63℃ 1h，82℃终止反应。

在步骤C结果判定步骤中加入的显色剂为SYBR Green I，判定方法为：反应结束后，分别在各反应管中加入2μL～3μL SYBR Green I，混匀后观察颜色变化，当阳性对照管显示淡绿色，阴性对照管显示淡橘红色时，显示淡绿色的管判为阳性，显示淡橘红色的管判为阴性。

本发明所涉及的检测试剂盒中RT-LAMP反应体系为：10×ThermoPol Buffer 2.5μl，Bst DNA聚合酶 1.0μl，10μM的外引物B3 1μl，10μM的外引物F3 1μl，80μM的内引物BIP 1μl，80μM 的内引物FIP 1μl，15ng/μl的cDNA 1μl，5M的Betaine 5μl，DEPC水补至25μL；其中该反应体系中还含有Mg²⁺ 3～15mM，dNTP 0.2～1.2mM。

所述反应体系中Mg²⁺和dNTP的具体优选浓度分别为7.5mM、0.4mM。