[发明专利]尿液样本细菌性病原体检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属临床微生物鉴定技术领域，具体涉及尿液样本细菌性病原体检测试剂盒及检测方法。

背景技术

世界范围内尿路感染是最常见的细菌性感染疾病之一，往往导致严重的尿脓毒症甚至病人死亡，尤其是免疫缺陷病人。研究表明，大约50％的妇女一生中至少发生过一次尿路感染。同时，每年大约有10％的儿童发生尿路感染而导致严重的发热性疾病伴随排尿困难及腹痛等症状。

目前，尿液半定量是临床上诊断尿路感染病原菌的标准方法，但是该法存在诸多缺陷。首先，从拿到尿液标本到得到病原菌鉴定结果需要48小时，而在这期间医生往往在没有确定病原菌的情况下采用经验性抗生素治疗，这会导致副作用的产生以及细菌耐药性。其次，尿培养需要经验丰富的专业人员才能进行。

其他一些快速检测尿液样本中病原菌的方法包括尿液镜检、尿素试验以及PCR等。尿液镜检是一种简单、快速的检测尿液病原菌的方法，但其缺陷在于只能检测尿液中有无病原菌而无法鉴定具体病原菌种属，并且其低敏感度也一定程度上限制了在临床上的广泛应用。尿素试验主要用于检测尿液中最为常见的肠杆菌科细菌，对单胞菌属及肠球菌属等不产生尿素的菌群无法检测。PCR结合DNA测序技术已经被证明是检测鉴定细菌及其他微生物的有效手段。以16S rRNA基因为测序片段进行细菌种属鉴定具有诸多优势。16S rRNA以多拷贝的形式存在于所有细菌中，其结构由8个保守区域及9个可变区组成。因此，在16S rRNA保守区设计引物理论上能扩增出绝大多数细菌的DNA片段，然后通过测定扩增产物中的可变区即可区分不同的细菌种属。

Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。该技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，通量高、操作方便，便于构建标准化操作流程，因此广受研究者青睐，并在很多方面已应用于临床微生物的分型鉴定及耐药检测。

Monstein等用焦磷酸测序技术检测幽门螺杆菌16S rRNA基因16S rDNA的V1和V3区序列，将胃镜活检标本中得到的23个幽门螺杆菌标本依据其V1区的核苷酸序列差异，鉴定出8种不同的等位基因类型，除11个样本与幽门螺杆菌26 695株序列一致、1个样本与199株的序列一致外，根据V1区的改变表现为有1个或2个核苷酸的突变或单个核苷酸的插入而分为4个等位基因类型。另有2个标本的V3区出现C至T转换，证明此技术可满足对临床病原菌标本的快速鉴定和分型。Unner stad等利用焦磷酸测序技术对106株不同血清型的单核细胞增生李斯特氏菌进行了分型，根据inIB基因第1575位和1578位核苷酸的变化，将血清型1/2a和1/2c分为一组，1/2b和3b分为一组，而血清型4b又可分为2个组。该技术还被应用于百日咳杆菌(Bordetella pert ussis)与副百日咳杆菌(Parapert ussis)等细菌的快速鉴定及分型。Martin等运用此技术对百日咳杆菌毒力相关ptxS1基因进行了分型鉴定，并与定量PCR作了方法学的比较，结果显示两种方法具有很好的一致性，焦磷酸测序技术适合百日咳杆菌的大规模筛选。此外，Alistair等用焦磷酸测序技术检测肠球菌的23s rRNA上的抗利奈唑胺位点，并与PCR-RFLP方法比较，结果显示了100％的一致性。Marjo等用焦磷酸测序技术检测鸟分支杆菌，肺炎链球菌，酿脓链球菌，空肠弯曲杆菌，流感(嗜血)杆菌等多种病原体的23S rRNA基因2058位多态性，以获得病原体的大环内脂抗药性信息。赵锦荣等建立了基于焦磷酸测序技术的高通量检测耐利福平结核分支杆菌的方法，并用传统的测序方法进行验证，结果显示了100％一致性，他们认为这种方法具有自动化程度高和结果准确等特点，相比传统的测序，具有更快速，简便等特点，适用于耐利福平结核分支杆菌的快速高通量的检测。