[发明专利]一种用HPLC测定纳豆激酶纯度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效液相测定纳豆激酶纯度的方法，属于分析检测领域。

背景技术

纳豆激酶作为新一代溶栓药物，具有药理作用直接且多元化、体内半衰期长、分子量相对较小，可直接通过胃肠系统被人体吸收、安全性高、价格便宜等诸多优点。此外，纳豆激酶还可以调节体内其他酶的活性以进一步加强溶栓效果，因此，纳豆激酶具有良好的开发成为新一代溶栓药物的潜力。

关于纳豆激酶纯度的测定方法通常采用电泳法，该法无法进行定量检测，也无法测定产品的具体纯度，为纳豆激酶精制及其药物的工业化生产带来很大障碍。目前未见文献报道有关于纳豆激酶纯度测定的有效方法，致使纳豆激酶的产品仍然停留在保健食品的阶段，而纳豆激酶广阔的药用前景亟待开发成药物用于治疗血栓等疾病，在国外，也尚未见有国家正式批准纳豆激酶作为药品治疗、生产的文件；在我国，以纳豆激酶为主体的溶栓药物尚未见于药物应用，仅有纳豆激酶制剂—恩开胶囊2000年进入中试阶段。

高效液相色谱法分离效率高、选择性好、灵敏度高、应用范围广和分析速度快，不仅适于各种多元组分复杂混合物的分析，而且能从一些复杂的混合物中排除干扰物质，并分析其中微量成分，定量分析目标物含量，为食品和药物成分的定性和定量提供了迅速可靠的途径。本发明提出的纳豆激酶高效液相色谱检测方法不仅可以准确对其纯度进行定量，为其开发成药物提供可靠原材料，而且为分离纯化过程的得率计算提供可靠依据，纳豆激酶HPLC纯度标准检测方法的建立为客观的表述纳豆激酶的纯度提供了可能。

发明内容

考虑到目前国内外没有建立纳豆激酶纯度的相关检测技术指标以及检测标准，本发明对其进行深入研究，制定检测方法相关标准，为纳豆激酶开发成药物提供技术支持。

本发明采用适合蛋白分析的Agilent ZORBAX 300SB-C₁₈色谱柱或Waters XBridge BEH300 C₄色谱柱，乙腈和0.1％TFA作为流动相，采用梯度洗脱程序进行分析，面积归一化法进行定量，建立能够在短时间内检测纳豆激酶纯度的HPLC方法。

高效液相色谱法对纳豆激酶的纯度进行测定，使用Waters2695液相色谱仪，配紫外检测器。具体检测条件为：

色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB-C₁₈色谱柱，75mm×2.1mm；

        Waters XBridge BEH300 C₄色谱柱，3.5μm；

流动相：乙腈/0.1％三氟乙酸(TFA)溶液，梯度洗脱程序见下表；

流速：1.0mL/min；

柱温：40℃；

进样量：20μL。

流动相梯度表

采用面积归一化法测定含量，采用高效液相色谱法测定纯度，能对药物成分的分析和定量提供迅速可靠的途径。

具体实施方式

1)样品制备

将经过发酵液的预处理、阴离子交换树脂去杂、阳离子交换树脂分离、大孔吸附树脂层析分离及冷冻干燥后得到的纳豆激酶样品，加水溶解，用高效液相色谱法进行纯度检测。

对照品：纳豆激酶原同质标准品(冻干品)，用超纯水复溶至蛋白浓度约1mg/mL，0.22μm水系滤膜过滤。

供试品：纯化干燥后的纳豆激酶样品(冻干品)，用超纯水复溶至蛋白浓度约1mg/mL，0.22μm水系滤膜过滤。

2)检测条件

固定相：Agilent ZORBAX 300SB-C18色谱柱

流动相：流动相A(含0.1％TFA的水)，取约800mL的双蒸水于1000mL容量瓶中，用1mL刻度吸管移取1mL TFA于上述量瓶中，用双蒸水定容至刻度，摇匀，0.22μm滤膜(水系)过滤，超声1min，即得；流动相B(含0.1％TFA的乙腈)，取约800mL乙腈于1000mL容量瓶中，用1mL刻度吸管移取1mL TFA于上述量瓶中，乙腈定容至刻度，摇匀，0.22μm滤膜(有机系)过滤，超声1min，即得。

HPLC参数设置：柱温40℃，样品池温度4℃，紫外检测波长280nm，流速1.0mL/min，10min内以B相30-70％的含量进行梯度洗脱；对照品分别进样10、15、20、25、30μL，供试品进样20μL。

对照品溶液分别进样10、15、20、25、30μL，以得到的色谱图中纳豆激酶峰面积为纵坐标、进样体积对应的蛋白总量为横坐标，绘制标准曲线，以此计算纳豆激酶样品的含量。