[发明专利]一种高效表达人血清白蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种高效表达人血清白蛋白的方法。 

背景技术

人血清白蛋白是血浆中的主要蛋白成分，由585个氨基酸组成，分子量为66kD。人血清白蛋白在血液中主要作用是维持正常渗透压，与钙离子、脂肪酸、氨基酸、胆红素和各种药物相结合，并起到转运载体的作用。临床上人血清白蛋白常用于外科手术、出血性休克、烫伤、肾病综合征导致的白蛋白缺乏症、肿瘤肝腹水等疾病的治疗。 

一直以来，人血清白蛋白是从人血液中纯化得到的。由于血源匮乏和病毒(肝炎、AIDS)污染等原因，基因重组人血清白蛋白在近十年中得到了国内外大型制药公司的重视。近年来，采用基因重组的方法，已经在酵母菌(USP5,330,901、JP11-509525、JP6-100592)、大肠杆菌(Lawn，R.M.Constructionof DNA sequences and their use for microbial production of proteins，in particularhuman serum albumin“European Patent Appl.”(1983)73，p646)、转基因牛奶(WO9602573A1 SEPARATION OF HUMAN SERUM ALBUMIN)中表达人血清白蛋白。 

尽管现有技术中已经在酵母等菌株中成功表达过人血清白蛋白，然而表达的效率以及表达的规模仍然不够理想。一般情况下，除了使用强启动子来提高目的蛋白的表达水平外，研究人员还经常使用一些其它方法，最常用的方法是提高插入到酵母基因组的目的蛋白表达盒拷贝数，此法可以提高表达量。但是这个策略也有局限，提高拷贝数不一定必然伴随着目的蛋白表达量的增高。即使有所增高，也不呈现着和表达盒的拷贝数成正相关的状况。蛋白表达量受很多因素的制约，有转录阶段的调控，翻译阶段的制约，以及翻译后的蛋白修饰等，因此特定的蛋白，需要找到合适的策略并结合大量的研究试验工作来优化 表达。 

综上，本领域还有必要进行进一步的研究，以提高人血清白蛋白的表达效率，使得人血清白蛋白真正实现高效地大规模工业化生产。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效表达人血清白蛋白的方法。 

本发明的另一目的在于提供用于高效表达人血清白蛋白的重组载体和基因工程菌株。 

在本发明的第一方面，提供一种重组表达人血清白蛋白的方法，所述方法包括： 

(1)提供一种重组酵母细胞，所述酵母细胞中同时包含有：由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒和由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒； 

(2)培养(1)的重组酵母细胞，从而表达人血清白蛋白。 

在一个优选例中，所述的由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒和由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒分别位于表达载体中。 

在另一优选例中，所述的表达载体是：pGAPZα表达载体或pPIC9K表达载体。 

在另一优选例中，所述的由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒位于pPIC9K表达载体中，所述的由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒位于pGAPZα表达载体中。 

在另一优选例中，先将含有AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒的pPIC9K表达载体转染酵母细胞，得到重组酵母细胞1；之后将含有GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒的pGAPZα表达载体转染重组酵母细胞1，得到(1)所述的重组酵母细胞。 

在另一优选例中，所述的人血清白蛋白的表达盒中，从5’至3’依次包括：启动子序列，SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列(部分酵母α信号肽3’端的编码序列)，白蛋白成熟肽编码序列，翻译终止子序列，这些序列操作性相连。 

在另一优选例中，在启动子序列之前以及翻译终止子序列之后，还包括多克隆位点(酶切位点)。 

在另一优选例中，所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。 

在另一优选例中，所述的毕赤酵母细胞是GS115亚型。 

在另一优选例中，所述方法还包括步骤： 

(3)分离(纯化)所述的人血清白蛋白。 

在本发明的另一方面，提供一种重组表达载体的组合，所述组合中包括： 

(a)含有由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒的表达载体；和 

(b)含有由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒的表达载体。