[发明专利]一种用LC-MS技术定量分析生物样品中小分子的方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种用LC-MS技术定量分析生物样品中小分子的方法。

背景技术

液相色谱质谱联用技术(LC-MS技术)，以其高灵敏度和高选择性，在定量分析，特别是小分子定量分析中的应用日益广泛。

LC-MS有正离子模式和负离子模式两种工作模式，分别只能检测到正离子和负离子。两种模式适合分析不同的化合物，因为有的化合物离子化容易形成正离子，有的化合物离子化则容易形成负离子。因此，对于含有多种未知组分的样品，或含有离子化特点不同组分的样品，必须分别在正离子模式和负离子模式下进行分析。

内标定量法是定量分析的常用方法，是将确定量的已知化合物(内标物)加入到样品中，与样品中的待测成分一同被分析，从而校准测定结果的方法。该方法特别适用于微量成分的分析，因为其能较好地降低分析误差。

为了用内标定量法在正离子模式和负离子模式下对同一样品进行分析，需要选择适宜的内标物。由于常见的大多数化合物往往很难在两种模式下都有良好的信号响应，因此不得不对两种模式分别建立内标物。如果能找到一种既能用于正离子模式，也能用于负离子模式的内标物，则能简化操作，提高工作效率。

另一方面，生物样品(血液、体液、组织匀浆、尿液、粪便等)一般为水性基质，若选择的内标物为脂溶性，或不能较好地溶解在基质中，则影响分析效果，甚至完全找不到内标物信号。

目前国内外文献尚为见到在生物样品分析中只用一种内标物同时分析两种模式的研究报道。

发明内容

本发明目的在于一种用LC-MS技术定量分析生物样品中小分子的方法。

本发明目的是通过如下方案实现的：

本发明生物样品中小分子的定量分析方法为：采用LC-MS技术，以苦杏仁苷作为内标物。

其中，所述的生物样品是指血清、血液、体液、组织匀浆、尿液或粪便。

其中，所述的小分子化合物是指分子量小于1000Da的化合物。

本发明定量分析方法中LC-MS方法的技术条件为：

色谱条件：流动相为A：含甲酸的水，B：含甲酸的乙腈；梯度洗脱或恒定比例洗脱；

质谱条件：电喷雾电离离子源(ESI)，正、负离子模式分别检测。

本发明定量分析方法中LC-MS方法的技术条件优选为：

色谱条件：Waters Acquity HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm I.D.，1.8μm)，柱温24℃；流动相为A：含0.1％甲酸的水，B：含0.1％甲酸的乙腈；洗脱梯度为0→1min，2％B，1→2min，2％→5％B，2→5min，5％→12％B，5→10min，12％→20％B，10→12min，20％→30％B，12→13min，50％→100％B，15→16min，100％B，16→17min，100％→2％B，17→20min，2％B，流速0.5mL/min，进样量，8μL；

质谱条件：电喷雾电离离子源(ESI)，正、负离子模式分别检测；正离子模式：m/z范围为70-1000，毛细管电压为2.9kV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100℃，脱溶剂温为450℃，脱溶剂气体流速为900L·h^-1，锥孔气流量50L·h^-1，锁校质荷比为m/z556.2771；负离子模式：m/z范围为70-1000，毛细管电压为3.0kV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100℃，脱溶剂温为450℃，脱溶剂气体流速为900L·h^-1，锥孔气流量50L·h^-1，锁校质荷比为m/z 554.2615。

本发明定量分析方法中内标溶液为：1.08mg/mL的苦杏仁苷溶液；配制方法为：精密称取苦杏仁苷，溶于50％乙腈配成1.08mg/mL的内标溶液。

其中，用本发明定量分析方法测血清中小分子化合物的步骤为：

A.样品处理方法：精密称取苦杏仁苷，溶于50％乙腈配成1.08mg/mL的内标溶液，将内标溶液20μL加入500μL血清中，混匀后滴加100μL 20％三氯乙酸，漩涡震荡30s，4℃条件下13000rpm离心10min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后供分析；

B.标准曲线样品配制：精确称取待测化合物，用50％乙腈溶解、稀释成为系列浓度溶液；取内标溶液和待测物溶液各20μL加入480μL空白血清中，混匀后滴加100μL 20％三氯乙酸，漩涡震荡30s，4℃条件下13000rpm离心10min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后供分析；