[发明专利]一种用LC-MS技术定量分析生物样品中小分子的方法

权利要求书

1.一种生物样品中小分子的定量分析方法，其特征在于该定量分析方法采用LC-MS技术，以苦杏仁苷作为内标物。

2.如权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于其中所述的生物样品是指血清、血液、体液、组织匀浆、尿液或粪便。

3.如权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于其中所述的小分子化合物是指分子量小于1000Da的化合物。

4.如权利要求1-3任一所述的定量分析方法，其特征在于其中所述LC-MS方法的技术条件为：

色谱条件：流动相为A：含甲酸的水，B：含甲酸的乙腈；梯度洗脱或恒定比例洗脱；

质谱条件：电喷雾电离离子源(ESI)，正、负离子模式分别检测。

5.如权利要求4所述的定量分析方法，其特征在于其中所述LC-MS方法的技术条件为：

色谱条件：Waters Acquity HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm I.D.，1.8μm)，柱温24℃；流动相为A：含0.1％甲酸的水，B：含0.1％甲酸的乙腈；洗脱梯度为0→1min，2％B，1→2min，2％→5％B，2→5min，5％→12％B，5→10min，12％→20％B，10→12min，20％→30％B，12→13min，50％→100％B，15→16min，100％B，16→17min，100％→2％B，17→20min，2％B，流速0.5mL/min，进样量，8μL；

质谱条件：电喷雾电离离子源(ESI)，正、负离子模式分别检测；正离子模式：m/z范围为70-1000，毛细管电压为2.9kV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100℃，脱溶剂温为450℃，脱溶剂气体流速为900L·h^-1，锥孔气流量50L·h^-1，锁校质荷比为m/z556.2771；负离子模式：m/z范围为70-1000，毛细管电压为3.0kV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100℃，脱溶剂温为450℃，脱溶剂气体流速为900L·h^-1，锥孔气流量50L·h^-1，锁校质荷比为m/z 554.2615。

6.如权利要求1-3、5任一所述的定量分析方法，其特征在于其中所述LC-MS方法的内标溶液为：1.08mg/mL的苦杏仁苷溶液；其配制方法为：精密称取苦杏仁苷，溶于50％乙腈配成1.08mg/mL的内标溶液。

7.如权利要求4所述的定量分析方法，其特征在于其中所述LC-MS方法的内标溶液为：1.08mg/mL的苦杏仁苷溶液；其配制方法为：精密称取苦杏仁苷，溶于50％乙腈配成1.08mg/mL的内标溶液。

8.如权利要求1-7任一所述的定量分析方法，其特征在于其中所述的生物样品为血清。

9.如权利要求8所述的定量分析方法，其特征在于该定量分析方法的具体步骤为：

A.样品处理方法：精密称取苦杏仁苷，溶于50％乙腈配成1.08mg/mL的内标溶液，将内标溶液20μL加入500μL血清中，混匀后滴加100μL 20％三氯乙酸，漩涡震荡30s，4℃条件下13000rpm离心10min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后供分析；

B.标准曲线样品配制：精确称取待测化合物，用50％乙腈溶解、稀释成为系列浓度溶液；取内标溶液和待测物溶液各20μL加入480μL空白血清中，混匀后滴加100μL 20％三氯乙酸，漩涡震荡30s，4℃条件下13000rpm离心10min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后供分析；

C.在正离子模式或负离子模式下，在LC-MS进样，测定血清中待测物的含量。

10.如权利要求8所述的定量分析方法，其特征在于其中所述的小分子化合物为阿魏酸和芍药苷，具体定量分析步骤为：

A.样品处理方法：精密称取苦杏仁苷，溶于50％乙腈配成1.08mg/mL的内标溶液，将内标溶液20μL加入500μL血清中，混匀后滴加100μL 20％三氯乙酸，漩涡震荡30s，4℃条件下13000rpm离心10min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后供分析；

B.标准曲线样品配制方法：精确称取芍药苷和阿魏酸，用50％乙腈分别溶解为1.08mg/mL和1.24mg/mL浓度的溶液，取上述两溶液混合，以50％乙腈稀释，配制成相当于芍药苷为129.6μg/mL、阿魏酸148.8μg/mL的混合储备液，将该储备液以50％乙腈稀释至系列浓度溶液，浓度范围为芍药苷0.259-77.76μg/mL，阿魏酸1.488-148.8μg/mL，同时配制浓度为1.08mg/mL的苦杏仁苷溶液作为内标溶液，取内标溶液和标准品溶液各20μL加入480μL空白血清中，混匀后滴加100μL 20％三氯乙酸，漩涡震荡30s，4℃条件下13000rpm离心10min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后供分析；

C.技术条件：

色谱条件：Waters Acquity HSS T3色谱柱(100mm×2.1mmI.D.，1.8μm)，柱温24℃；流动相为A：含0.1％甲酸的水，B：含0.1％甲酸的乙腈；洗脱梯度为0→1min，2％B，1→2min，2％→5％B，2→5min，5％→12％B，5→10min，12％→20％B，10→12min，20％→30％B，12→13min，50％→100％B，15→16min，100％B，16→17min，100％→2％B，17→20min，2％B，流速0.5mL/min，进样量，8μL；

质谱条件：电喷雾电离离子源(ESI)，正、负离子模式分别检测；正离子模式：m/z范围为70-1000，毛细管电压为2.9kV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100℃，脱溶剂温为450℃，脱溶剂气体流速为900L·h^-1，锥孔气流量50L·h^-1，锁校质荷比为m/z556.2771；负离子模式：m/z范围为70-1000，毛细管电压为3.0kV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100℃，脱溶剂温为450℃，脱溶剂气体流速为900L·h^-1，锥孔气流量50L·h^-1，锁校质荷比为m/z 554.2615；

D.测定化合物含量：负离子模式测定血清阿魏酸含量，正离子模式测定血清芍药苷含量。