[发明专利]猪肉质性状相关基因BTG3及制备方法和应用

权利要求书

1.一种分离的猪肉质性状基因BTG3，其序列为SEQUENCE NO.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的一种猪肉质性状相关基因BTG3的制备方法，其步骤是：

A、 引物设计：

用人BTG3基因的mRNA 序列为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90%以上的猪ESTs序列，用DNAstar中的SeqMan程序构建猪EST-重叠群，获得由重叠群拼接构成的一致序列，然后用Primer　Premier 5.0 软件设计引物扩增BTG3基因cDNA 782~916 位点间长度为135 bp 的片段，引物序列如下：

B3POLF：5’- GATATTCCCACCTCTTCCA -3’ ,

B3POLR：5’- GGTTTATTCTTCCTTCCCT -3’ ；

B、PCR产物的纯化、克隆和测序：

PCR产物的纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5 mL Ependorff管中，用PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，步骤是每100mg的凝胶中300 μL的S1液，于65℃温育10min至凝胶完全融化，将S1/DNA混合物转入回收柱，9200g离心30s，使浆液通过Minicolumn挤出，将下面管子中的废液倒掉，再加入500μL的W1液至管中，9200g离心15s，倒掉管中的废液，再加入500μL的W1液，静置1min，9200g离心30s，取下Minicolumn装入1.5 ml Ependorff管中，加入25 μL的灭菌水或者TE液，静置1min之后，9200g离心1 min，以洗脱DNA存于Ependorff管中；

C、连接反应：将纯化的PCR产物与pMD18-T 载体连接，连接反应总体积是5 μl，其中包括2.5 μl 2×ligation buffer，0.5 μl 载体，1μl纯化PCR产物，最后加入1 μl灭菌水置4℃水浴过夜；

D、感受态细胞的制备：从37℃培养了16~20 h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3 h，转接1 ml 菌液于含有30 ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养4h，待OD₆₀₀达到0.3~0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10~15 min，然后将菌液转入离心管中于4℃ 4,000g离心10 min 以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10 ml冰预冷的0.1 mol/L 的CaCl2重悬沉淀，冰浴30 min，重复4℃ 4,000g离心10 min一次，用4 ml冰预冷的0.1 mol/L 的CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用；

E、转化：无菌状态下取100~120 μl 感受态细胞于1.5 ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30 min后42℃ 热激90 s，取出后冰浴3~4 min，加入400 μl无抗生素的LB液体养基，37℃振荡培养45 min，取100μl涂布于已提前4 h涂布了IPTG和X-gal的含Amp的琼脂平板上，37℃平放1 h后倒置培养，测序结果显示在该片段47bp处存在C、T碱基突变，该处C-T的改变造成氨基酸由脯氨酸变为丝氨酸。

3.权利要求1所述的一种猪肉质性状相关基因BTG3在猪标记辅助选择中的应用。