[发明专利]非洲爪蟾dmrt5基因神经特异性调控元件及其载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种控制神经系统特异表达的顺式调控元件的克隆及其转基因载体的构建方法。

背景技术

顺式调控元件是指基因周围能与特异转录因子结合而影响其转录的DNA序列，例如启动子、增强子、衰减子等功能元件。顺式调控元件能够特异性调控基因的时空表达，因此顺式调控元件的特异性决定了它所调控基因的在组织及细胞水平的特异性表达。

爪蟾(Xenopus laevis)基因组中的Dmrt5基因含有两个外显子和一个内含子，mRNA长度为2592nt，含有Dmrt基因家族中保守的DM域，还有DMA和DMB两个保守区域。目前，对于Dmrt5的研究还非常有限，斑马鱼、小鼠等模式动物胚胎的原位杂交等基因表达实验表明，Dmrt5主要在神经系统和生殖腺中组织特异性表达。为了研究Dmrt5的组织特异性表达的规律以及它们的功能，采用生物信息学、比较基因组学以及分子生物学的手段，克隆了Dmrt5基因第一个外显子5’端上游的一段长度为3371bp的潜在启动子区域，并且利用显微注射技术，将含有该启动子区域和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒注射到爪蟾受精卵中，观察到EGFP的瞬时表达。为了进一步鉴定该启动子控制Dmrt5组织特异性表达的功能，并进一步找到能够控制基因组织特异性表达的功能元件，本实验采取I-SceI介导的高效转基因方法，将该启动子区域和EGFP插入到爪蟾基因组中建立转基因爪蟾品系鉴定其中的功能元件，为实施组织特异性的基因过表达和基因敲低奠定了基础。

I-SceI是酵母(Saccharomyces cerevisiae)线粒体内含子编码的一种内切酶，识别一个18bp(TAGGGATAACAGGGTAAT)的识别位点，引入DNA的双链断裂(Monteilhet，Perrin et al.1990)，产生一个4bp突出的末端。因为I-SceI的识别位点有18个bp，所以在7×1010的随机序列中只出现一次，在普通的脊椎动物基因组中，一般都没有I-SceI的识别位点。因为I-SceI可以引入DNA的双链断裂，常常被用于基因组修复、同源重组和基因替换等研究。最近，发展出了一种I-SceI介导的转基因技术，可以用于首建动物分析和建立转基因动物品系，以进行基因表达分析、异位表达和基因敲低实验，对基因调控网络特别是顺式调控进行研究。

I-SceI方法的一个潜在缺陷是转基因的镶嵌表达，如果注射的时间太晚或者注射胚胎的培养温度太高这种情况有时候会发生(Ogino et al.2006a)。所有注射必须在卵受精后的45分钟内完成，因为注射的DNA插入到宿主基因组中的时间窗口限制在一细胞期的早期。注射后，胚胎必须培养在能够耐受的最低温度(X.tropicalis22℃，X.laevis 12-13℃)知道他们达到二细胞或四细胞期，用于刺激转基因的插入。I-SceI酶活性的丧失，比如在-20℃储存超过几个月，也会导致转基因镶嵌表达或者甚至转基因完全失败。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种非洲爪蟾dmrt5启动子的克隆及其转基因载体的构建方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种非洲爪蟾dmrt5基因神经特异性调控元件，该调控元件的核酸序列为SEQ ID No.1所示。

一种上所述非洲爪蟾dmrt5基因神经特异性调控元件的转基因载体pCS2-IS-Dmrt5-EGFP的构建方法，包括以下步骤：

(1)采用生物信息学，查找发现Dmrt5基因第一个外显子5’端上游的一段长度是3371bp的潜在启动子区域。提取非洲爪蟾基因组DNA，并设计针对调控元件的引物序列，以基因组DNA作为模板进行PCR扩增。

(2)将扩增好的调控元件序列片段连入PMD18-T，构建PMD18-T-Dmrt5质粒，用测序验证得到的片段是正确的调控元件。

(3)构建转基因载体pCS2-IS-Dmrt5-EGFP。

进一步地，所述步骤(1)中，所述扩增爪蟾Dmrt5启动子保守区序列所用引物P5如SEQID NO.2所示，扩增爪蟾Dmrt5启动子保守区序列所用引物P3如SEQ ID NO.3所示。所述扩增扩增目的启动子片段的反应体系为：10×Buffer 15μl、dNTP(2.5mM)1.75μl、p5(10μM)2μl、p3(10μM)2μl、基因组DNA 1μl、ROCHE Taq 0.75μl、pH2O 37.5μl。