[发明专利]制备唾液酸的方法和专用固定化大肠杆菌细胞

说明书

技术领域

本发明涉及制备唾液酸的方法和专用固定化大肠杆菌细胞。

背景技术

唾液酸(Sialic acid)是一族神经氨酸(Neuraminic acid)衍生物，是含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，它是生物杂聚物的重要组成部分，主要以短链残基的形式存在于糖蛋白和糖脂的末端。从1957年发现这种物质以来，唾液酸已经被证明对体内多种生物学功能具有重要意义。目前主要应用领域有三个方面：一是药物前体市场，二是婴儿食品市场，三是保健品市场.

无论是作为具有保健功能的食品添加剂还是用于生产具有治疗功能的临床药物，唾液酸都具有广泛的应用前景和较高的市场价值，但是，唾液酸的生产则一直处于较低水平，难以满足将来市场大规模的需求。

唾液酸单体的生产主要有化学合成法、提取法、酶法合成和微生物发酵四种。化学合成法：成本高，需要用到贵重金属铟，反应条件苛刻，纯化困难。提取法：从植物或动物组织中提取唾液酸，如：燕窝、鸡蛋、动物脏器和部分植物等，由于唾液酸的含量低，来源少，受客观因素影响大，污染也很大，不利于工业推广。酶法合成：唾液酸醛缩酶不易获得，同时需要N-乙酰-D-甘露糖胺和丙酮酸作为底物，原料成本高，导致终产品价格昂贵。而最常用的是微生物发酵，其生产原理是通过微生物发酵工艺，使特定的细菌在生长过程中合成胞外多聚唾液酸。将菌体去除后，上清液即为多聚唾液酸，多聚唾液酸经过进一步精制后，在特定的条件下进行解聚，获得唾液酸单体。运用离子柱层析纯化唾液酸单体，获得纯的唾液酸单体制品。微生物发酵属于生化过程，所以原料费用低廉，产品成本很低，但常规发酵方法菌种培养需要较多的时间、人力与物力，其生产效率还不高。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种固定化大肠杆菌细胞。

本发明所提供的固定化大肠杆菌细胞，是通过包括如下步骤的方法得到的：

1)将聚乙烯醇水溶液和海藻酸钠水溶液混合，得到I液；

2)将步骤1)得到的I液与大肠杆菌菌悬液混合，得到II液；

3)将步骤2)得到的II液滴加到氯化钙和硼酸的混合水溶液中，放置，得到固定化大肠杆菌细胞。

所述大肠杆菌菌悬液是大肠杆菌的生理盐水溶液；

所述将步骤1)得到的I液与大肠杆菌菌悬液混合的体积比为10∶1；所述II液中，聚乙烯醇、海藻酸钠和大肠杆菌的配比为1g聚乙烯醇∶0.1g海藻酸钠∶1×10⁸-1×10⁹CFU大肠杆菌，具体为1g聚乙烯醇∶0.1g海藻酸钠∶1×10⁸CFU大肠杆菌或1g聚乙烯醇∶0.1g海藻酸钠∶1×10⁹CFU大肠杆菌；

所述步骤3)中所述II液的温度为38℃-42℃，具体为38℃、40℃或42℃；所述氯化钙和硼酸的混合水溶液的温度为4℃；所述II液与所述氯化钙和硼酸的混合水溶液的体积比为1∶50。

所述聚乙烯醇的数均分子量为1750g/mol；

所述I液中聚乙烯醇的浓度为100g/L，海藻酸钠的浓度为10g/L；

所述大肠杆菌菌悬液中菌浓度为1×10⁸CFU/ml-1×10⁹CFU/ml，具体为1×10⁸CFU/ml或1×10⁹CFU/ml；

所述氯化钙和硼酸的混合水溶液中氯化钙的浓度为20g/L，硼酸的浓度为40g/L。

所述放置的方法为先在25℃放置4小时，然后在4℃下放置16-20小时，具体为16小时、18小时或20小时；

所述滴加的方法为用注射器滴加；所述注射器的针头直径为0.4mm。

所述大肠杆菌为大肠杆菌菌种C8。

所述固定化细胞的直径为2mm-4mm。

本发明的另一个目的是提供一种制备唾液酸的方法。

本发明所提供的制备唾液酸的方法，是将所述的固定化大肠杆菌细胞发酵培养，得到唾液酸。

所述方法中，在所述发酵培养后，包括如下提取步骤：将所述发酵培养后得到的发酵液中的固定化大肠杆菌细胞取出后，将剩余的发酵液离心，取上清液经超滤浓缩后，加入硫酸铵水溶液，在0℃进行沉淀，取上清再离心，得到的上清液为唾液酸；所述发酵液为发酵容器内的所有物质。

所述发酵培养的培养基由以下成分组成：

山梨醇、硫酸铵、胰蛋白胨、磷酸氢二钾、硫酸镁和水；

以上成分在所述培养基中浓度分别为：