[发明专利]一种细胞保存液、其制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种细胞保存液，以及该细胞保存液的制备方法和用途。本发明还涉及检测HPV或HPV DNA的试剂盒和方法。

背景技术

目前，市面上销售的细胞保存液多为以醇类、抗凝剂、缓冲溶液等为主要成份的细胞保存液。例如：

公开号为EP0511430A2的欧洲专利申请公开了一种细胞保存液，其主要成分为醇类、乙酸、以及盐离子等。其中：醇类(45％-55％)，主要有甲醇、乙醇及异丙醇；抗凝剂(2-4％)，主要为EDTA及其盐；缓冲溶液(6％-8％)，为磷酸缓冲液、醋酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液等。

公开号为CN101363011A的中国专利申请公开了一种宫颈脱落细胞保存液，其主要成分为醇类、抗凝剂、缓冲液、盐离子、抗微生物试剂、以及粘液溶解剂。其中：醇类(20％-50％)，主要有甲醇及乙醇、异丙醇；抗聚集剂(15-50％)，为EDTA；缓冲液(5％-10％)，主要为醋酸盐缓冲溶液；离子强度维持剂(1-20％)，主要为氯化钾；抗生物试剂(0.01％-0.5％)，主要为抗生素。粘液溶解试剂(0.1％-5％)，主要为二硫键打开试剂；清洁剂(0％-0.5％)，主要为表面活性剂。

然而，这些保存液的目的是将保存的细胞用于细胞学检测(例如TCT检测，即液基薄层细胞学检测)，因此侧重于固定细胞结构，维持细胞或蛋白质的形态，但是对DNA的保存并不理想。随着技术的发展，质谱检测和DNA测序等已经成为重要的检测手段，检测结果的准确性对和细胞DNA样本的收集、储存、以及制备的要求越来越高，现有的细胞保存液已不能适应技术发展的需求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明经过大量的实验和不懈的努力，发明了一种细胞保存液，其便于收集脱落细胞，并且能够有效地保存细胞DNA及感染细胞的病毒DNA，便于DNA提取操作且能兼顾细胞结构保存。该细胞保存液粘稠度低、流动性强，更适于DNA提取以及后续的DNA检测，并且本发明人还惊奇地发现，使用该细胞保存液时，细胞(特别是脱落细胞)的初始采集量和保存量都很大，并且对DNA的保存时间和保存效果也都很好。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种细胞保存液，包括固定剂、固定剂辅助剂、抗凝剂、缓冲液、以及离子强度维持剂，其中，所述抗凝剂的含量为0.01％-1.5％(w/w)，所述离子强度维持剂的含量为0.01％-1％(w/w)，并且所述细胞保存液不含有二硫键打开试剂。

在本发明中，术语“二硫键打开试剂”是指能够打开二硫键的试剂，例如甲基半胱氨酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、二羟基二硫苏糖醇、2-巯-乙醇等等。

在本发明的一个实施方案中，所述抗凝剂的含量为0.1％-1％(w/w)，优选为0.1％-0.5％(w/w)，例如为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、或0.5％(w/w)。

在本发明的一个实施方案中，所述抗凝剂为螯合试剂EDTA和/或EDTA的水溶性盐(EDTA的钾盐、钠盐、或锂盐等，例如EDTA-K₂，EDTA-Na₂等)，也可选用肝激酶、链激酶等。然而，肝激酶、链激酶对PCR反应有一定的抑制作用，并且主要应用于血液制品，因此优选的是EDTA和/或EDTA的水溶性盐。

抗凝剂的主要作用为去除络合重金属离子，防止细胞凝结。由于血液样本含有的细胞数及血浆中蛋白及金属离子较多，现有技术中抗凝剂的用量较大，有时会达到15％-50％的程度。在宫颈脱落细胞保存液中，细胞数较少，且多数为完整细胞，游离蛋白和金属离子较少。而且过量的EDTA会抑制HPV-DNA检测的PCR等过程反应，因此对抗凝剂的用量进行了适当的减少，通过实验证明，在成本减低的基础上，仍能保证同样的抗凝效果。

在本发明的一个实施方案中，所述离子强度维持剂的含量为0.1％-1％(w/w)，优选为0.5％-1％(w/w)，更优选为0.8％-1.0％，例如为0.8％、0.9％、或1.0％(w/w)。

在本发明的一个实施方案中，所述离子强度维持剂为NaCl和/或KCl等氯化盐。

离子强度维持剂的主要作用为维持离子强度，保持固有的细胞渗透压，维持细胞形态，防止细胞破裂，防止DNA消化酶及蛋白酶释放到保存液中。离子强度维持剂不仅要能够溶解在保存液中还不能产生抗凝剂(EDTA)沉淀，而且过高的离子强度会使细胞脱水皱缩。维持离子强度的物质要在先前溶液中额外加入，或另外兼容于缓冲液中。