[发明专利]血栓靶向溶栓融合蛋白mAnxB1ScuPA及其构建与应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及用基因工程方法制备血栓靶向性溶栓蛋白mAnxB1ScuPA，并构建表达载体。

背景技术

血栓性疾病，如急性心肌梗塞(AMI)、脑血栓、深静脉血栓等，发病凶险，死亡率和致残率都极高。溶栓疗法是治疗血栓性疾病的主要手段。目前临床上所用的溶栓剂主要有两类，第一代溶栓剂以链激酶(SK)、尿激酶(UK)为代表，无纤维蛋白特异性，用药量大，易诱发全身纤溶的激活导致严重出血，且SK具有较强的抗原性，易对某些患者造成过敏反应；第二代溶栓剂主要包括单链尿激酶(Scu-PA)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、甲氧苯甲酰纤溶酶原激活剂(APSAC)等，这些药物对血栓部位的纤维蛋白具有一定的亲和力，半衰期有所延长(AP-SAK)，但仍存在以下问题：一是临床常规剂量已足以迅速启动整个纤溶系统，产生的系统纤溶活力完全掩盖了他们具有的相对特异性，引起出血。二是初始再灌注延迟或失败，现有的溶栓药物从开始治疗到实现再灌注，平均需45分钟以上，此时部分心肌壁层已经坏死。再通率也只有60-80％。三是再栓塞，由于溶栓治疗后的残留血栓表面吸附有大量的凝血酶，在溶栓后重新启动凝血过程所致。因此，针对上述第一代和第二代溶栓药物的不足，目前国内外正在积极利用蛋白质工程手段开发靶向性更强、不良反应更低的第三代溶栓剂，一方面提高对纤维蛋白或活化血小板血栓的亲和力，延长半衰期，减少出血；另一方面发展抗凝、溶栓双功能溶栓剂，防止再栓塞。

第三代溶栓药物的研制主要包括两类：一类是利用蛋白质工程技术进行对现有药物进行突变和定向改造，此类药物主要是对t-PA进行的改造而获得的，包括瑞替普酶(reteplase)、兰替普酶(lanoteplase，NPA)、替尼普酶(tenecteplase，TNK-t-PA)、孟替普酶(monteplase)等；另一类是寻找血栓靶向分子，研制导向溶栓药物。导向溶栓剂一般由两部分组成：一部分起“弹头”作用，负责将溶栓药物运送到血栓部位，目前常用的是纤维蛋白或活化血小板的单抗；另一部分则是“弹药”即溶栓部分，主要指尿激酶原及其衍生物、t-PA等。早期的导向溶栓剂研究主要是通过化学偶联的方法，将抗体和溶栓药物进行化学合成。但是，利用化学偶联法得到的导向溶栓剂具有很多缺点，如产物不均匀、活性损失大、产率低等，所以近年来人们逐渐利用基因工程的方法来制备导向溶栓剂。比如将t-PA的B链基因和Scu-PA32k基因接在单抗59D8重链第三恒定区基因的后面，构建表达载体，然后转入重链表达缺陷的59D8杂交瘤细胞中，表达rScuPA32k-59d8蛋白在兔静脉血栓试验中，溶栓效率比Scu-PA强20倍(参见文献Runge MS，Quertermous T，Zavodny PJ，et al.A recombinant chimeric plasminogen activator with high affinity for fibrin has increased thrombolytic potency in vitro and in vivo.Proc Natl Acad Sci USA1991；88：10337-10341.)。

血栓形成是一个复杂的级联反应，活化血小板起到了至关重要的作用：首先是血小板活化后使原来居于质膜内侧的膜磷脂如磷脂酰丝氨酸(PS)暴露，为凝血因子IX、X等的激活提供了一个催化表面；其次是血小板活化后释放出一些新的凝血因子，促进血小板的进一步聚集和活化。因此，活化的血小板是抗凝和溶栓药物设计的一个有效靶点，比如利用RGD肽同尿激酶B链融合，体外实验表明，融合蛋白RuB具有与尿激酶相似的纤溶活性，同时对活化血小板具有较高的亲和力(参见文献朱甫祥，邢桂春，贺福初。RGD肽与尿激酶B链融合蛋白原核重组表达质粒的构建、表达和功能的初步分析。生物工程学报2000，16：582-85.)。