[发明专利]中药注射剂微量蛋白质检测方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及中药注射剂杂质检测领域，用于检测中药注射剂蛋白质类杂质，以控制中药注射剂的质量。

技术背景

中药注射剂最早产生在上世纪四十年代，由钱信忠等学者开创。在中国，中药注射剂已经广泛应用于临床。2010年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)一部就收录有灯盏细辛、清开灵、止喘灵及双黄连等单方和复方注射剂。中药注射剂在推进中药剂型发展，拓展中药的应用范围，服务广大人民健康等方面的确功不可没。安全、有效、质量可控依然是中药注射剂的基本质量要求。从技术上来讲，业界大体上已经解决了中药注射剂的有效性问题(尽管作用机制尚不完全清楚)，对于安全性依然是业界难题。

然而，随着中药注射剂的广泛应用于临床，其不良反应日益暴露，特别是致死性不良反应也屡有报道。根据目前公开的不良反应资料，中药注射剂的不良反应可以累及各个系统和脏器，甚至导致死亡。很多中药注射剂的不良反应与原有的药理作用无关，根据多方面分析，这些不良反应主要属于超敏反应，即病理性免疫反应，包括I、II、III和IV型病理性免疫反应。病理性免疫反应仍是免疫反应，必须有抗原的参与，其抗原可以是半抗原或完全抗原。半抗原多属于小分子成分，完全抗原多为大分子成分，以蛋白质最为多见。因此减少中药注射剂中的抗原性成分是提高中药注射剂安全性的关键策略之一。

中药注射剂大多为植物提取物。作为生物提取物，在原料提取过程中会带来多种植物大分子杂质，如蛋白质、核酸等。尽管植物中的蛋白质含量较低，通过有机溶剂提取的量较少，但微量的蛋白仍足以诱发过敏反应。与人相比，植物蛋白与人的同源性差异大，因此常常具有很强的抗原性。现行《中国药典》(2010年版)控制中药注射剂蛋白含量的方法仍沿用了以前的磺基水杨酸比浊法，控制的蛋白质限量约为37～110μg/ml左右，低于此限量的蛋白药典方法很难检出。因此，蛋白含量低于37μg/ml的中药注射剂将被视为“合格”。而且中药注射剂中的酸性成分会干扰磺基水杨酸法检测蛋白的结果，这导致磺基水杨酸法应用范围受限。而其他未被药典采用的蛋白质检测方法如，凯氏(Kjeldahl)定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法、直接考马斯亮兰法(Bradford法)、紫外吸收法以及BCA法等，却因为中药注射剂其他成分或本身颜色带来严重干扰，要么特异性较差，要么灵敏度较差，不适合用于中药注射剂的蛋白质限量检测。蛋白质类杂质属于一类杂质，包含了不同性质或分子量的蛋白质，因此也很难用HPLC和/或质谱等仪器分析方法进行检测。

中药注射剂中存在的微量蛋白成分带来了安全性问题，从严控制中药注射剂中的蛋白质杂质，有利于提高中药注射剂的安全性。因此建立特异性高并且灵敏的中药注射剂蛋白质检测方法很有必要。

由于中药注射剂都有较深的颜色，成分多样，而且蛋白质是一类物质，因此很难用目前单一方法同时提高检测的灵敏性和特异性。因此本发明是针对中药注射剂的特点而建立的，对蛋白质检测具有灵敏度高、抗干扰能力强的特点。

在我们申请的前一项专利(201010199693.3)中，我们发明了一种检测中药注射剂的微量蛋白方法，检测的灵敏度约为12μg/ml，比2010年版《中国药典》方法高3倍左右。在本专利中，我们参照专利(201010199693.3)的原理将方法进行了改进，检测的灵敏度将得到进一步的提高。

发明内容

本发明利用某些膜能和蛋白质特异性高强度吸附的特点以及考马斯亮蓝对蛋白质特异性显色的特点建立本方法，以提高中药注射剂微量蛋白检测的灵敏性和特异性。本方法包括以下三个步骤：

1、先将蛋白质特异性吸附膜浸泡在拟检测的中药注射剂溶液中；

2、用含有有机溶剂的溶液洗涤蛋白质吸附膜，以消减中药注射剂本身的颜色干扰；

3、将蛋白质吸附膜进行考马斯亮蓝显色。

在以上步骤1中，吸附蛋白质的膜包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜(Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜)；浸泡于中药注射剂溶液中蛋白质吸附膜的面积大小为1mm²-0.1m²；浸泡蛋白质吸附膜的中药注射剂溶液的体积0.1ml-1000ml；中药注射剂溶液包括但不限于中药注射液、中药注射用冻干粉针剂及其稀释或浓缩液。

在以上步骤2中，采用的有机溶液浓度为0-100％，有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、氯仿。采用有机溶液洗涤的量和洗涤的次数不限，以去除或减弱中药注射剂本色为度。如果被中药注射剂溶液浸泡后的蛋白质吸附膜几乎无色，本步骤可以跳过直接进入步骤3。