[发明专利]基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物基因检测技术领域的检测方法，具体是一种基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法。

背景技术

高通量分析技术的发展为分子生物学中大量核酸分子的平行分析提供了一种有效的途径，目前广泛应用于医疗诊断、食品安全监控、以及环境监测等众多领域中。

基于DNA的聚合酶链式反应(PCR)是目前应用最为广泛的核酸分子分析技术。基于DNA的PCR分析的特点在于它的特异性和灵敏性。目前高通量的检测方法主要是结合了一个或几个常规复合PCR扩增方法和高通量的扩增产物检测方法，或者直接应用复合PCR扩增方法进行检测。直接的复合PCR检测技术已经在成功的应用于许多领域中不同核酸分子的同时扩增，但是其只能用于少量核酸分子(小于10个)的平行扩增分析。复合PCR技术应用于更多不同核酸分子的高通量分析较难实现，主要是因为常规的复合PCR方法中存在两个主要缺陷：一是大量的引物同时存在于一个体系，容易引起非特异性的扩增；二是，由于扩增效率的差异导致其中部分目标分子优先扩增。随着复合PCR中添加的引物对数增加，以及扩增的循环数的增加，这种缺陷带来的限制会表现的更加明显。

组合了复合PCR扩增和芯片或毛细管电泳技术的方法，可极大地提高核酸DNA分子分析的通量。这种组合检测方法，通常的是在一个或几个复合PCR扩增后，应用高通量的DNA芯片或毛细管电泳进行快速、自动的产物检测，这可以同时对大量的样本平行地进行小型化、高通量和自动化分析。根据相关的报道，在1-2cm²的高密度芯片上可以形成大约10⁶个分析位点，数千个目标可以同时进行检测。但是，目前应用DNA芯片技术分析成本比较高、操作步骤复杂、技术要求较高，而且大多数芯片具有目标特异性的特点，不同的应用领域需要设计不同的芯片进行目标分析。此外，由于目标分子仍然采用复合PCR方法进行扩增，扩增的通量必然受到复合PCR固有缺陷的限制，因此这种组合方法的广泛应用受到了一定的限制。一些新的组合了高通量的目标分子扩增技术和快速、自动的产物分离技术的方法成为目前高通量核酸DNA分子分析技术研究的重点。

微滴PCR(microdroplet PCR)技术是一种在乳化剂中进行的新型的、高效的高通量核酸DNA分子扩增技术。一般的，在微滴PCR中，单个DNA分子被分配到体积极小(0.5fl到0.5nl的体积)的微滴中，这允许在1微升的乳化剂中形成大约107个反应平行的进行扩增，消除了复合PCR的固有缺陷。提高了目标扩增的通量，同时减少了试剂和样品的消耗。然而，在微滴PCR中使用大量不同的引物同时进行多目标分析时，仍然具有一定的限制，因为在微滴形成的过程中，大量的引物的随机分配，使得每个微滴中的只含有相同的引物和相应的目标DNA分子是不可能的。当许多不同的引物存在微小的微滴中进行PCR扩增时，会产生类似于复合PCR扩增限制。因此，本发明建立了一种新的组合方法，首先应用一个或几个复合PCR，利用带有通用尾巴序列的特异性引物进行少数几个循环的预扩增，预扩增的产物两端分别会带有一段通用序列；随后在单一的微滴PCR方法中应用一对同通用序列尾巴互补的通用引物扩增所有的预扩增目标产物；最后，扩增PCR产物经过纯化后，应用毛细管电泳进行自动分离检测。这种组合检测方法可实现对大量的目标DNA分子同时进行高通量的扩增和检测。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，优化了MPIC(multiplex Microdroplet PCR Implemented CGE，基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法)方法反应的体系和条件，评估了该方法的特异性和灵敏度，并在目前广为关注的转基因产品检测领域中应用本发明对样品中转基因成分进行了分析，确定了该分析方法的灵活性和可应用性。本发明可做为生物学研究中高通量DNA分子分析的一种手段，对多个DNA分子同时进行检测，提高了分析的通量，极大的减少了宝贵的样品和试剂的消耗。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤：

第一步：多重模板的合成：将含有不同目标DNA分子的纯化DNA模板通过一个或几个常规复合PCR应用目标特异性引物进行预扩增，产生含有通用序列尾巴的多重模板；

所述的纯化DNA模板是指应用DNA提取试剂盒，从原材料中分离纯化的获得的用于PCR扩增的基因组DNA。