[发明专利]一种重组病毒载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术，尤其是涉及一种用编码骨保护素和成纤维生长因子的核苷酸序列和病毒载体序列构建的重组病毒载体。

背景技术

牙周病(periodontitis)在世界范围内均有较高的患病率，在我国更居于龋病之上。牙周病的患病率和严重性随年龄增长而增高，50～60岁时达到高峰。随着我国进入老龄化社会，牙周病更将成为突出的影响人类健康和生存质量的问题。牙周病特征性表现为附着丧失、牙槽骨吸收，在病变牙周组织中各种刺激因素导致的破骨细胞活化，抑制了牙周组织的成骨能力，造成牙周支持组织不可逆性损害，而牙槽骨的渐进性吸收、破坏是造成牙齿脱落的主要原因之一。所以，一些学者认为缺损牙槽骨的再修复是一项全球性的社会和医学问题。而传统的治疗方法对再生组织成分缺乏主动的诱导分化和加速生长作用，不能使牙周组织完全修复。

当前临床治疗重症牙周病的过程中，往往由于手术中患牙位置、患病部位、现有器械和技术水平等因素，无法根除病变坏死牙周组织、细菌毒素及其代谢产物；其次，由于口腔是个开放的、多种细菌共生的生态环境，无法避免术后手术部位重新被细菌所侵袭；同时牙周组织中成骨细胞、牙周膜细胞等在细菌作用下可产生内源性的前列腺素(PGE)、白细胞介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)和基质金属蛋白酶等细胞因子，这些细胞因子可引起牙槽骨吸收及软组织破坏。

人体骨骼是动态的不断变化的组织，循环重复着骨吸收-重建，开始于破骨细胞的分化、成熟、迁移、附着于骨表面并完成骨吸收，随后是成骨细胞形成新骨，这个过程受成骨细胞调控。成骨细胞/骨髓基质细胞表达破骨细胞分化因子(RANKL)，促进破骨细胞的分化及骨吸收；同时分泌骨保护素(OPG)，以防止过度骨吸收。在由骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中成骨细胞分泌RANKL和OPG的比率不同：未成熟的成骨细胞/骨髓基质细胞分泌更多的RANKL，而成熟的成骨细胞分泌更多OPG，以确保骨吸收和骨形成两个过程紧密相连并达到平衡。

OPG属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，是RANKL的天然抑制剂，可竞争性地抑制RANKL与RANK的结合，抑制前体破骨细胞的增殖、分化及存活，抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性，从而抑制骨吸收[6]。Mogi M等(J Dent Res，2004，83(2)：166-169)研究发现，慢性牙周炎患者龈沟液中RANKL浓度增高，OPG浓度明显下降，牙周炎病人骨吸收病变区黏附的病变肉芽组织中RANKL表达明显高于非牙周炎组织，OPG在非牙周炎组织中表达高于牙周炎组织[7]，提示OPG可促进牙周组织生长。

姜新朋等(吉林大学学报，2008，34(4)：633-635)研究发现：人牙髓细胞在不同浓度碱性成纤维生长因子(bFGF)作用下可促进细胞增殖，赵征等(临床口腔医学杂志2005，21(4)：203-206)经过大量实验也证明FGF-2在成人牙周炎病损组织中表达阳性率显著高于正常组织，提示FGF-2是牙周病损组织修复的重要细胞因子，可能通过调节人牙周膜细胞(periodontal ligament cells，PDLCs)的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性和合成纤维连接蛋白(fibronectin，Fn)的水平，发挥PDL细胞在牙周组织的再生中的作用，同时FGF-2能显著地抑制人PDLCs胶原酶II、IV的表达，进而促进牙周组织再生。

因此，从骨吸收-重建分子机理入手，应用基因治疗技术增加牙周组织中OPG分泌，从而抑制RANKL的功能，阻断破骨细胞增殖、分化与成熟，辅以促进组织增殖FGF-2的应用，来探讨治疗重症牙周病牙周组织缺损的方法。

腺病毒载体在自然界分布广泛，具有许多独特的优点：病毒基因不与宿主细胞基因组整合，安全性较好；感染的宿主细胞范围广泛，而且可感染非分裂期细胞；插入外源基因容量大，制备和操作简便；病毒繁殖滴度高且易于纯化；细胞及动物实验表明，腺病毒载体很容易将外源基因直接转移到靶细胞中，并使其在细胞内有效表达成活性蛋白。上述优点，使腺病毒被广泛用于基因治疗的载体。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能促进牙周组织生长的重组病毒载体。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：一种重组病毒载体，该载体包括一个病毒载体和至少两条核苷酸序列，所述核苷酸序列分别编码骨保护素和成纤维生长因子。

所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、SV40病毒载体、反转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒载体。

所述腺病毒载体是缺失性腺病毒载体。