[发明专利]一种鸭疫里默氏杆菌LAMP检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌LAMP检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer，RA)病是一种主要侵害鸭、火鸡和其他鸟类的禽类接触性传染病，其血清型复杂，迄今为止，已公认的RA有21个血清型(1～21型)，各血清型之间缺乏交叉保护的能力。该病主要病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪样输卵管炎等，发病率高，病死率高，耐过鸭多成僵鸭，生长迟缓，造成极大的经济损失，是目前危害禽类养殖业的主要传染病之一。

鸭疫里默氏杆菌病多继发其他疾病或与其他传染性疾病并发，其临床症状和病理解剖往往缺乏特征性，增加了疾病的诊断和防治难度，必须通过实验室诊断进行确诊。目前实验室的诊断方法主要包括细菌学方法(如细菌的分离鉴定)、血清学方法(如酶联免疫吸附试验)和分子生物学(如聚合酶联式反应)等方法，但上述方法所需检测时间长、特异性和灵敏性低且必须配备专用设备，操作复杂，常有非特异性出现。

近年来，由NotomiT等开发的一种简单、迅速、特异的核酸扩增方法环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，被广泛的应用于多种病毒性疾病和细菌性疾病的诊断中(Notomi，T.，Okayama，H.，Masubuchi，H.，et al.Nucleic Acids Res.2000(28)，e63；K.Nagamine，T.Hase，T.Notomi.Molecular andCellular Probes.2002(16)：223-229)。该技术使用4条不同引物识别6个不同区域的靶基因，应用链置换扩增反应在恒温条件下完成扩增；具有很高的扩增效率，在15到60min内可将DNA扩大10⁹-10¹⁰倍；不需要特殊试剂和精密设备。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、特异性和灵敏性高的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒和检测方法。

为此，本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌LAMP检测试剂盒，其包含3对引物：F3和B3；FIP和BIP；LF和LB，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述LF的核酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述LB的核酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一些实施例中，所述鸭疫里默氏杆菌LAMP检测试剂盒还含有荧光染料、10×反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP(2.5mM each)、甜菜碱(Betaine solution，5M)。所述荧光染料为能与双链DNA结合产生荧光的染料，可为溴化乙锭、SYBRGreen I荧光染料或Hoechst 33258，最优选为SYBR Green I荧光染料。

另一方面，本发明还公开了一种鸭疫里默氏杆菌的检测方法，包括下列步骤：

a)取禽类的体液或组织液并以此为模板；

b)利用3对引物：F3和B3；FIP和BIP；LF和LB进行LAMP反应，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述LF的核酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述LB的核酸序列如SEQ ID NO.6所示，反应条件为94℃5分钟，0℃20秒，65℃ 20-60分钟，80℃灭活；

c)检测LAMP反应产物。

在一些实施例中，所述禽类为鸭、火鸡、鸡或鸟类中任何之一。

在一实施例中，步骤b中所述反应条件为94℃5分钟，0℃20秒，65℃20分钟，80℃灭活；

在一些实施例中，步骤c中所述检测LAMP反应产物的方法为琼脂糖凝胶电泳法、荧光显色法或分光光度计法。所述荧光显色法为SYBR Green I荧光显色法。

与现有技术相比，本发明具有如下的优点：

1)6条引物对序列的8个特异区域进行识别，扩增反应只有在6条引物完全识别靶序列的情况下才能进行，在很大程度上减少了扩增反应的背景，保证了LAMP扩增的高度特异性。

2)对硬件设备基本无要求，在普通的生物学实验室就可完成检测工作，减少了污染的机会并方便了实验过程中的质控工作。