[发明专利]VEGF-165及HβD3双基因质粒载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因治疗领域，具体地说，涉及可在基因重组技术中使用的质粒载体及其构建方法；更具体地说，是涉及具有VEGF-165和HβD3双基因真核表达重组质粒载体及其构建方法。

背景技术

随着社会经济的发展和工业化程度的日益提高，创伤与其他意外伤害所致的死亡在我国已成为仅次于恶性肿瘤、心脑血管疾病、呼吸系统疾病的第四大死亡原因，在青壮年中则占第一位。因此，深入开展创伤与创伤后组织修复的研究不仅是创伤医学深入发展的需要，也是现代社会发展的重要需求。目前，对于颌面部及人体其它部位创伤的修复，特别是大型组织缺失的创伤修复多采用“以创伤修复创伤”的治疗模式，虽然对局部创伤组织缺失的修复起到明显的疗效，挽救了患者生命，创伤后一次性组织瓣移植修复创伤缺损也大大缩短了患者的治疗时间，但是由于组织瓣的来源是患者身体其它部位的正常机体，术后必定为供区带来新的创伤，留下新的瘢痕，甚至功能障碍，对患者术后的生活质量带来一定的影响。如何以“无创修复创伤”的方式治疗这一疾病，是目前急待解决的课题。

机体损伤后出现协调的愈合过程，其中包括多种细胞、细胞因子和细胞外基质之间错综复杂的网络作用。细胞因子在创伤愈合过程中具有重要作用，它能调节创伤修复过程中的多种细胞反应，影响细胞增殖、迁移、细胞外基质合成和释放等。在众多细胞因子中，血管内皮生长因子(VEGF)是一重要的促愈合因子，免疫组化显示VEGF的表达主要位于上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞的胞浆中，无论是在伤前组织还是伤后不同修复阶段的组织中，VEGF均呈持续性阳性表达，提示VEGF在颌面部组织中具有较为丰富的来源，显示了其所能发挥的作用。因此，我们特异性选择VEGF作为促进创面愈合的活性多肽，是较为理想而可行的。

对于创口中的感染采用抗菌素治疗是常用的方法，确能有效抑制或杀灭敏感细菌，但抗菌素不能中和毒素、不能抵抗真菌，此外，尤其是广谱抗菌素还可加重机体内F常生态菌群失调节器，更进一步削弱了机体内环境微生态屏障，形成新的感染诱发因素。研究发现防御素(defensin)有明显的杀菌和抑菌作用，并有抗真菌和中和毒素的作用，其效果与防御素量呈正相关，防御素在机体内抗感染方面具有独特的优点。防御素是机体抵御病原微生物入侵的天然免疫的重要介质，人类β防御素(1～3)广泛表达于口腔组织，如口腔粘膜、唾液腺、牙龈、舌等组织，在口腔上皮天然宿主防御反应中发挥重要作用。其中β防御素-3相对于其它防御素对盐浓度不敏感，对多药抗药性的金色葡萄球菌和抗万古霉素的粪肠球菌具有强大的杀菌作用，对革兰氏阳性菌杀伤力更强，并且不影响口腔内环境微生态菌群，不伤害人体组织细胞，是理想的抗口腔内感染的活性抗菌肽。

综上，本发明针对人体软组织创伤临床发生率高，危害重，治疗难的科学问题，拟优选VEGF-165和防御素-3为实现既促进创面上皮修复，又能增强机体免疫的协同治疗策略解决问题，为有效治疗机体软组织创伤提供新途径。

发明内容

本发明的目的之一：是构建一种人VEGF-165和人防御素3双基因重组质粒载体，为基因治疗机体软组织创伤提供新的途径。

本发明的目的之二：是提供上述重组质粒载体的构建方法。

本发明的目的之一，主要通过以下技术方案实现：

VEGF-165和HβD3双基因质粒载体，其特征是：所述的重组质粒载体包括人VEGF-165和人HβD3基因。

其中，VEGF-165基因序列如序列表1所述。HβD3基因序列如序列表2所述。pVIVO1-mcs质粒载体的结构图如表3所示，HβD3基因插入到载体MCS1位点即968-974bp区域，VEGF-165基因插入到载体MCS2位点即4085-4098bp区域。利用pVIVO1-mcs质粒载体系统，构建成重组质粒pVIVO1-mcs-VEGF165-HβD3。

本发明所用质粒载体pVIVO1-mcs，是双基因共表达真核载体，宿主范围广，转染效率和基因表达水平高，暂时性表达，安全性较好，是基因治疗的优良载体，应用于创伤愈合和组织工程等较为理想。

本发明的目的之二，主要通过以下技术方案实现：

一种VEGF-165和HβD3双基因质粒载体的构建方法，主要包括以下几个步骤：

1)获得人VEGF-165和人HβD3基因；

2)用NcoI和EcoRI对HβD3DNA和质粒pVIVO1-mcs进行双酶切，采用粘端连接法进行连接，获得重组质粒pVIVO1-mcs-HβD3；