[发明专利]VEGF-165及HβD3双基因质粒载体及其构建方法

权利要求书

1.VEGF-165及HβD3双基因质粒载体，其特征在于：所述重组质粒载体包括人VEGF-165cDNA，和人HβD3cDNA，其中VEGF-165cDNA基因序列为：

CCGCCTCGGCTTGTCACATCTGCAAGTACGTTCGTTTAACTCAAGCTGCCTCGCCTTGCAACGCGAGTCTGTGTTTTTGCAGGAACATTTACACGTCTGCGGATCTTGTACAAACAAATGCTTTCTCCGCTCTGAGCAAGGCCCACAGGGATTTTCTTGTCTTGCTCTATCTTTCTTTGGTCTGCATTCACATTTGTTGTGCTGTAGGAAGCTCATCTCTCCTATGTGCTGGCCTTGGTGAGGTTTGATCCGCATAATCTGCATGGTGATGTTGGACTCCTCAGTGGGCACACACTCCAGGCCCTCGTCATTGCAGCAGCCCCCGCATCGCATCAGGGGCACACAGGATGGCTTGAAGATGTACTCGATCTCATCAGGGTACTCCTGGAAGATGTCCACCAGGGTCTCGATTGGATGGCAGTAGCTGCGCTGATAGACATCCATGAACTTCACCACTTCGTGATGATTCTGCCCTCCTCCTTCTGCCATGGGTGCAGCCTGGGACCACTTGGCATGGTGGAGGTAGAGCAGCAAGGCAAGGCTCCAATGCACCCAAGACAGCAGAAAGTTCAT；

HβD3cDNA基因序列为：

ATGAGGATCCATTATCTTCTGTTTGCTTTGCTCTTCCTGTTTTTGGTGCCTGTTCCAGGTCATGGAGGAATCATAAACACATTACAGAAATATTATTGCAGAGTCAGAGGCGGCCGGTGTGCTGTGCTCAGCTGCCTTCCAAAGGAGGAACAGATCGGCAAGTGCTCGACGCGTGGCCGAAAATGCTGCCGAAGAAAGAAATAA。

2.如权利要求1所述的VEGF-165及HβD3双基因质粒载体，其特征在于：利用pVIVO1-mcs质粒载体系统，构建成重组质粒pVIVO1-mcs-VEGF165-HβD3。

3.VEGF-165及HβD3双基因质粒载体的构建方法，其特征在于：包括以下几个步骤：

1)获得人VEGF-165和人HβD3基因；

2)用NcoI和EcoRI对HβD3DNA和质粒pVIVO1-mcs进行双酶切，采用粘端连接法进行连接，获得重组质粒pVIVO1-mcs-HβD3；

3)再用BspHI和HindIII对重组质粒pVIVO1-mcs-HβD3和VEGF DNA进行双酶切，采用粘端连接法进行连接，得到重组质粒pVIVO1-mcs-VEGF165-HβD3；

4)脂质体介导重组质粒转染293FT细胞，外源基因在细胞中表达。

4.如权利要求3所述的VEGF-165及HβD3双基因质粒载体的构建方法，其特征在于：通过RT-PCR获得人VEGF-165和人HβD3基因。

5.如权利要求4所述的VEGF-165及HβD3双基因质粒载体的构建方法，其特征在于：根据Genebank中基因序列设计合成扩增VEGF-165和HβD3的PCR引物：

其中扩增VEGF-165的PCR引物序列是：

正向5’-CCCAAGCTTCACCGCCTCGGCTTGTC-3′，引入HindIII位点，

反向5’-CGTCATGACCATGAACTTTCTGCTGT-3′，引入BspHI位点，其中扩增H βD3的PCR引物序列是：

正向5′-CATGCCATGGCAGCTATGAGGATCCAT-3′，引入NcoI位点，

反向5′-CCGGAATTCTCAGGGTTTTTATTTCT-3′，引入EcoRI位点。