[发明专利]重型肝炎相关基因hFas microRNA腺病毒表达质粒的构建方法及其药学用途

说明书

本发明是重型肝炎相关基因hfg12、hFas和hTNFR1microRNA腺病毒表达质粒的构建方法及其药学用途的分案申请，原申请号200810133445.1，申请日是2008年07月18日。 

技术领域

本发明涉及构建一组基因生物制剂，即构建重型肝炎相关的人fg12(Human Fibrinogen-like protein 2，hfg12)凝血酶原酶、Fas和肿瘤坏死因子受体I(tumor necrosis factor，TNFR1)基因的microRNA腺病毒表达质粒，在重型肝炎中联合应用三种质粒进行治疗，验证其药学用途。 

背景技术

由于病毒性肝炎发病率高、危害性大，已成为严重影响人民健康与生活水平、制约经济发展的重要疾病。迄今为止，国际上对于重型肝炎尚无确定有效的治疗方法，探索重型肝炎的发病机制和防治方法是应用基础和临床研究领域的重要课题。 

用鼠3型肝炎病毒(mouse hepatitis virus-3，MHV-3)感染不同种系近亲繁殖小鼠，我们已成功建立了类似人类各种不同临床类型的肝炎，包括暴发型肝炎、慢性肝炎及临床健康病毒携带者(专利申请号：02115980.7)；MHV-3诱导产生的鼠fg12(mfg12)凝血酶原酶(纤维介素)基因在鼠病变肝组织中选择性高度表达，其基因表达水平与肝组织纤维蛋白沉积及广泛肝细胞坏死密切相关；MHV-3感染小鼠接 受鼠fg12凝血酶原酶中和抗体注射后可减轻肝脏疾病严重程度并显著降低死亡率。以上结果表明，鼠fg12凝血酶原酶在鼠暴发型肝炎的发病过程中起重要作用。在上述研究的基础上，我们进一步研究发现重症乙型肝炎病人肝脏组织的枯否氏细胞、血管内皮细胞和坏死、纤维化区域发现人fg12(hfg12)凝血酶原酶高度表达，fg12在病毒性肝炎中引发肝脏纤维蛋白沉积和微血管内微循环障碍，导致肝细胞坏死，表明人fg12凝血酶原酶在人病毒性肝炎的恶化进展中起着关键性的作用。 

重型肝炎的肝细胞死亡包括细胞坏死和细胞凋亡。迅速发生的凋亡是引发暴发性肝炎的重要机制之一。Fas基因广泛表达于人体组织中，属于肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)，并被命名为CD95。Fas/FasL通过介导细胞凋亡，在感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤的发生中起重要的作用，是病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病、急慢性肝衰竭和移植性排斥反应等造成肝组织细胞炎症损伤的重要环节。肝细胞对Fas介导的凋亡非常敏感。文献报导，病毒抗原激活肝细胞表达Fas，局部大量浸润的CTL表达FasL，引起肝细胞凋亡，肝细胞Fas/FasL表达程度与病变活动性一致，Fas介导的肝细胞凋亡在肝损伤中起非常重要的作用。 

肿瘤坏死因子(TNF)包括TNFα和TNFβ，其中TNFα主要是由活化的单核/巨噬细胞分泌，是具有广泛的生物学活性的多肽调节因子，在内毒素性休克、炎症、免疫调节、细胞毒性和抗病毒活动中起着重要作用。TNFα诱导的各种细胞反应是通过细胞表面两种特异性受体而产生的，即55KD的肿瘤坏死因子受体I(TNFR I)和75KD的 肿瘤坏死因子受体II(TNFR II)。TNFα的许多生物学效应包括细胞凋亡都是通过TNFR I产生的，而TNFR II则起着辅助信号转导的作用。TNFR I的高表达所致的肝细胞凋亡在人类重型肝炎的发生发展中起着重要作用。 

临床上多种病因可致重型肝炎，其发病凶险，患者短期内可出现大面积肝细胞死亡，目前缺乏特异有效的治疗手段。研究表明Fas、TNFR I系统介导的肝细胞凋亡与重型肝炎的肝损伤有关，抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞大量激活并高度集中于患者肝脏，通过Fas/FasL或TNFα/TNFR I诱导细胞凋亡，进而杀伤肝细胞。hfg12凝血酶原酶在病毒性肝炎中引发肝脏纤维蛋白沉积和微血管内微循环障碍，导致肝细胞坏死。上述研究表明人fg12凝血酶原酶、Fas/FasL和TNFα/TNFR I系统在人重型肝炎的恶化进展中起着关键性的作用。