[发明专利]血清中胆固醇酯的两步酶测定方法

说明书

技术领域

本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪快捷、准确检测血清中胆固醇酯的两步酶测定方法。

背景技术

血清中胆固醇以两种形式存在，一种为游离胆固醇(FC)；另一种为胆固醇与脂肪酸结合的胆固醇酯(CHE)。胆固醇酯正常值为2.34～3.38mmol/L(占总胆固醇的60～80％)。测胆固醇酯(CHE)具有临床意义，其增高常见于胆道梗阻、甲状腺功能减退、高脂血症和动脉粥样硬化等病症。其降低常见于严重肝病、甲状腺功能亢进、严重感染和营养不良等病症。胆固醇酯增高更易患心脑血管疾病。当胆固醇水平随着年龄或饮食条件的改变而上升时，胆固醇酯也同时上升。胆固醇酯与总胆固醇(TC)比值正常值为0.6～0.8∶1。胆固醇酯与总胆固醇比值有临床意义：(1)鉴别肝内外黄疸：阻塞性黄疸比值正常，肝细胞性黄疸比值降低。(2)增高：预示肝细胞损伤、病毒性肝炎早期、家族性卵磷酯胆固醇酰基转移酶缺乏等病症。因此临床上经常需要检测胆固醇酯。

血清中胆固醇的测定方法一般可分为化学法、酶法和色谱法3大类。早期测定方法是萃取法和化学法。美国疾病控制中心总胆固醇的测定方法为Lidberman-Burchard改良法。目前世界上大多数国家及我国检测血清胆固醇一般都采用酶法。另外还可采用高效液相色谱仪测定血清中的胆固醇及总胆固醇，但其检测成本高，速度慢、不易自动化、难以在临床推广。

目前国内几乎所有临床实验室都采用酶法测定胆固醇。采用酶法检测血清胆固醇的水平，一般都包括以下几个基本反应步骤：先用表面活性剂将脂蛋白分解成胆固醇、胆固醇酯和蛋白质。再选用最合适的胆固醇酯酶水解胆固醇酯，生成胆固醇和脂肪酸。水解后的胆固醇和血清中原有的游离胆固醇被胆固醇氧化酶氧化生成H₂O₂，在过氧化物酶(POD)的催化下，H₂O₂和4-氨基安替比林(4-AAP)、2，4-二氯酚(也可使用4-氯酚、苯酚衍生物、苯胺盐和苯磺酸盐，下面就以2，4-二氯酚为代表叙述，其他色原不再重复提起，)形成有色染料(常为醌亚胺类)，这些物质的生成量与样本中胆固醇的含量成正比。最后通过分光光度法计算出相应的胆固醇浓度。由于与血清中原有的游离胆固醇反应结果一起计算，所以计算结果是总胆固醇浓度。具体反应见化学反应式1～4。

现在许多临床实验室都采用生化分析仪测定血清中胆固醇，采用的也是酶法，其方法是将胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、POD、4-氨基安替比林和2，4-二氯酚、表面活性剂及防腐剂等组分溶解Tris-HCl缓冲液中(CHOD-PAP法)配制成单一试剂。此法具有简便快速、微量、精密度高的优点，且特异性强，反应线性范围宽，易达到终点。但由于血清中胆固醇酯水解后产生的胆固醇与血清中原有的游离胆固醇都参与了反应，所以用一步法测定的是血清中总胆固醇即游离胆固醇与胆固醇酯之和。目前许多实验室采用两步法测定，既将上述单一试剂分成两部分，以胆固醇氧化酶、POD、2，4-二氯酚为试剂I，以胆固醇酯水解酶、4-氨基安替比林作为试剂II。也有的以胆固醇酯水解酶、2，4-二氯酚为试剂I，以胆固醇氧化酶、4-氨基安替比林和POD作为试剂II。检测时先加入试剂I，反应完后再加入试剂II，分两次加入反应试剂进行测定，上述两步法中第一套试剂在加入试剂I后血清与试剂I反应，但不能生成有色染料，加入试剂II后，游离胆固醇和胆固醇酯均转化生成有色染料。第二套试剂在加入试剂I后就将胆固醇酯水解，游离胆固醇和胆固醇酯同时生成有色染料，其两步法测定结果还是总胆固醇。因此不管一步法还是两步法测定结果均为总胆固醇。如果要测定胆固醇酯，需测定总胆固醇后，再测定游离胆固醇，相减计算出胆固醇酯的含量。同样液相色谱测定也是如此，做两次测定后再相减计算，因此使检测都不能实现自动化。

发明内容：

为了能简单、方便、快捷及准确地测定胆固醇酯，本发明提供一种经济方便易行，准确性高、能够不受内源性胆固醇影响的血清中胆固醇酯的两步酶测定方法。