[发明专利]融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种融合酶蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是一个含9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，广泛存在于许多生物体内，随着生物进化程度的增加，唾液酸及衍生物在生物体内的含量亦增加。在动物体内和多种微生物表面，因唾液酸带有一个羧基而赋予细胞和许多复合糖的负电荷性质。在细胞与细胞之间、细胞与外界环境之间的信号传递和识别过程中，唾液酸残基起着至关重要的作用。经过近十几年的发展，糖生物学和糖化学在生物工程和制药工业中的作用日显重要。在以糖为基础的治疗药物中，流感病毒唾液酸酶抑制剂的开发是一个成功的例子。如上所述，由于唾液酸酶对于新生成病毒从细胞表面的唾液酸受体释放是必需的，因此抑制唾液酸酶可终止病毒的复制，呈现该病的严重性减弱和病程缩短。如葛兰素公司推出的抗病毒新药Zanamivir就是N-乙酰神经氨酸的类似物。

唾液酸是一种必需的和丰富的定位于细胞表面聚糖末端的氨基糖。它在很多生物学中有重要作用，比如病毒侵染，病毒的神经氨酸酶移走受感染细胞表面的唾液酸是其形成病毒颗粒后进行释放的基本步骤。因此唾液酸类似物被广泛的应用于抗病毒药物。如葛兰素公司推出的抗病毒新药Zanamivir就是N-乙酰神经氨酸的类似物，可以阻抑A和B型流感病毒的神经氨酸酶，它已经被商业化生产，用于避免高致病H5N1病毒的感染。

由于唾液酸存在于人乳中，并且大量研究已经证实唾液酸对于增强婴儿的免疫力和提高大脑的发育有重要作用，唾液酸可以添加到一些婴幼儿奶粉中。因此唾液酸的规模化生产对于医药及食品工业有重要的作用。

唾液酸的酶法合成主要是以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸钠为底物，在N乙酰神经氨酸醛缩酶的作用下生成N-乙酰神经氨酸。但是由于N-乙酰甘露糖胺的价格昂贵，所以实际上有“化学加酶法”和“双酶法”两种方法。“化学加酶法”是将廉价的N乙酰葡萄糖胺在碱性条件下进行异构化生成N-乙酰甘露糖胺，但是此方法回收率较低，环境污染严重，限制了其大规模应用。“双酶法”是采用N乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶制备成N-乙酰甘露糖胺，但是该酶提取困难，重组表达的酶活比较低，并且两个酶催化两步反应工艺复杂，不能满足大规模生产的需求。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，公开了一种融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)利用重叠PCR技术，将N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的基因连在一起，导入毕赤酵母宿主细胞中，从而获得具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸异构酶活性的融合蛋白；

(2)反应体系的pH为6.5-8.0，反应温度为30-40℃，N-乙酰葡萄糖胺与丙酮酸及其盐的重量比为1-1.2，将N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸及其盐与游离的融合酶蛋白或者固定化的融合蛋白混匀，反应得到混合物；

(3)从反应混合物分离制备N-乙酰神经氨酸。

所述的步骤(1)中的融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶为E.C.5.1.3.8；融合蛋白中N-乙酰神经氨酸醛缩酶为E.C.4.1.3.3。

所述的融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶包括具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶活性的多肽，N-乙酰神经氨酸醛缩酶包括具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的多肽；

所述的融合蛋白的融合方式：(1)第一区位于融合蛋白的N端，第二区位于融合蛋白的C端；(2)第一区位于融合蛋白的C端，第二区位于融合蛋白的N端；

优选的融合方式为N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶N端与N-乙酰神经氨酸异构酶C端融合。

所述的步骤(1)中的融合蛋白还包括在N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸异构酶之间加入0-30个长度的氨基酸作为连接肽。

所述的步骤(1)中的融合蛋白还包括在N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸异构酶之间加入10个氨基酸长度或(G₄S)₅作为连接肽，优选(G₄S)₅作为连接肽。

所述的反应体系的pH为6.5-8.0，反应温度为30-40，N-乙酰葡萄糖胺与丙酮酸及其盐的重量比为1-1.8，其中优选pH 7.5，温度36℃，N-乙酰葡萄糖胺与丙酮酸及其盐的重量比为1.5倍。