[发明专利]融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法

权利要求书

1.融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)利用重叠PCR技术，将N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的基因连在一起，导入毕赤酵母宿主细胞中，从而获得具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸异构酶活性的融合蛋白；

(2)催化反应体系的pH为6.5-8.0，反应温度为30-40℃，N-乙酰葡萄糖胺与丙酮酸及其盐的重量比为1-1.8，将N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸及其盐与游离的融合酶蛋白或者固定化的融合蛋白混匀，反应得到混合物；

(3)从反应混合物分离制备N-乙酰神经氨酸。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是所述的步骤(1)中的融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶为E.C.5.1.3.8，N-乙酰神经氨酸醛缩酶为E.C.4.1.3.3。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是所述的步骤(1)中融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶包括具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶活性的多肽，N-乙酰神经氨酸醛缩酶包括具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的多肽。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是所述的融合蛋白的融合方式为：(1)第一区位于融合蛋白的N端，第二区位于融合蛋白的C端；(2)第一区位于融合蛋白的C端，第二区位于融合蛋白的N端。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是所述的步骤(1)中的融合蛋白包括在N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸异构酶之间加入0-30个长度的氨基酸作为连接肽。

6.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是所述的融合蛋白的宿主细胞是细菌或酵母或动物细胞或植物细胞。

7.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是所述的步骤(1)中的融合蛋白在宿主细胞内表达或从宿主细胞中分泌出来。

8.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是所述的步骤(1)中的融合蛋白包括固定后的酶蛋白。

9.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是所述的步骤(2)中固定化的融合蛋白所用的载体为高分子合成材料或木炭或陶瓷或玻璃或纤维素。