[发明专利]乙型肝炎病毒表面抗原呈阳性的确认方法和试剂盒

说明书

【技术领域】

本发明涉及乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis Virus B SurfaceAntigen，HBsAg)免疫检测领域，特别涉及一种使HBsAg化学发光免疫测定呈有反应性或在“灰区”范围内的样本检测结果得到确认的检测方法与试剂盒。

【背景技术】

乙型肝炎病毒(Hepatitis Virus B，HBV)是乙型肝炎的病原体。HBsAg是HBV感染的重要血清学标志。在血清(或其他体液)中存在HBsAg表明受检者感染HBV。HBsAg实验室检测方法主要为免疫测定，常用的是放射性免疫法(RIA)、酶联免疫测定(ELISA)和化学发光免疫检测(CLIA)。化学发光免疫分析是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析。它具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器简单经济等优点。CLIA发展迅猛，已占各种免疫分析的首位，是目前放射免疫分析和酶联免疫分析最佳的取代者。灵敏度高是化学发光免疫分析关键的优越性，其灵敏度可达10-16mol/L(RIA为10-12mol/L)。化学发光免疫分析能够检出酶联免疫分析方法无法检出的物质，对疾病的早期诊断具有十分重要的意义。CLIA发光强度在4～6个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系，这与显色的酶免疫分析吸光度(OD值)为2.0的范围相比，优势明显。

HBsAg化学发光免疫检测的基本原理和操作步骤如下(参见图1)：在聚苯乙烯微孔板的反应孔内包被针对HBsAg的特异性抗体(抗-HBs)，在反应孔中加入待测样本，保温反应、洗涤后加入酶标记的抗-HBs，如果样本中含有HBsAg，则在反应孔中形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs·酶复合物。在酶的催化作用下，发光底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体，当中间体回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量RLU(Relative LightUnit，相对光单位)，该RLU与样品中的待测物质的量成正比。样本的RLU值大于Cutoff值(临界值)为阳性，小于Cutoff值为阴性。

在HBsAg的化学发光免疫检测中，很多原因可导致假阳性反应。如样本中可能存在非特异性干扰物质如：嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠IgG抗体和交叉反应物质等。另外一些外源性干扰物质或操作不当均能引起假阳性反应。为了简化检测步骤和缩短检测时间，国产的HBsAg化学发光免疫检测试剂多采用一步法，即样本和酶标记抗-HBs同时加入，如图2所示。这种一步快速法总体上讲也能满足临床需要，但由于缺乏了两步法中第一步反应后的洗涤，样本中如有非特异性干扰物存在，测定中可能促发假阳性反应。另外，为了缩短时间，快速法试剂成分的改变也增加了非特异性反应出现的可能。

由于HBsAg阳性可作为HBV感染的一种依据，国外对于HBsAg化学发光免疫检测呈阳性的样本称为有反应性，一般都要进行确认，排除假阳性后才能报告HBsAg阳性。

国外HBsAg化学发光免疫检测试剂的实际敏感度一般显著高于其标示的敏感度，加之国外试剂的精密度较好(Cutoff值附近的变异系数小于10％)，因此低于Cutoff的样本即可判为HBsAg阴性，而高于或等于Cutoff值的样本则需进行确认以排除假阳性。国内HBsAg化学发光免疫检测试剂的实际敏感度一般与标示的敏感度相近，精密度略差(出厂时要求变异系数小于15％，临床测定中的变异系数可能更高)，因此测定数值在Cutoff值附近一定范围内的样本就无法确定其是有反应性还是无反应性，而出现“灰区”问题。因此，样本检测结果如果在“灰区”内，HBsAg的确认试验不仅要确认属于“有反应性”的样本是否为HBsAg阳性，也要排除实际属于“无反应性的”HBsAg阴性样本。

【发明内容】

基于此，有必要提供一种HBsAg呈阳性的确认方法，以进一步确认HBsAg化学发光免疫检测的有反应性的结果，排除传统的该检测方法中存在的假阳性。

同时，还有必要提供一种HBsAg呈阳性的确认试剂盒。

一种HBsAg呈阳性的确认方法，包括如下步骤：提供HBsAg化学发光免疫检测的测定结果为有反应性的样本；向样本中加入特异性抗-HBs；另外向样本中加入不含特异性抗-HBs的对照试剂作为对照；对加入特异性抗-HBs的样本及加入对照试剂的样本分别进行HBsAg的化学发光免疫检测；比较加入特异性抗-HBs的样本及加入对照试剂的样本的RLU，若加入特异性抗-HBs的样本的RLU比加入对照试剂的样本的RLU下降至少30％，提示样本为HBsAg阳性。