[发明专利]肠毒素C2超抗原突变蛋白和编码基因及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及肠毒素C2超抗原突变蛋白，具体的说是一种具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白和编码基因及其制备和应用。

背景技术

超抗原(superantigen，SAg)是一组由细菌或病毒编码的，并在极低浓度下对人体或其他哺乳动物T淋巴细胞产生极强免疫刺激活性的蛋白质分子。不像传统的抗原，超抗原不需要抗原递呈细胞的加工处理，在抗原递呈细胞外侧的抗原结合区与MHC II(组织相容性复合物)分子和T细胞Vβ区结合形成复合物，从而激发大量的T淋巴细胞增殖，进而导致在体外或体内释放大量的细胞因子和其它效应分子。正因为超级抗原存在这种特殊的生物活性和作用机理，所以致使其可以作为一种临床上的免疫调节剂和抗肿瘤药物，用于的肿瘤治疗。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2(肠毒素C2，Staphylococcal enterotoxinC2，SEC2)是一类具有代表性的微生物外毒素。由于其极强的T细胞激活功能，成为一类典型微生物超抗原，近年来受到人们的广泛关注。但是，由于肠毒素C2超抗原的作用必须依赖于与免疫系统中的MHC II分子相结合，这必然会导致其在人体中可能与来自正常组织或细胞的MHC II分子的结合，从而对正常细胞也产生一定的毒性作用；此外，由于金黄色葡萄球菌肠毒素是一种细菌外毒素，因此在对人体会产生一定的毒素综合症(TSS)和食物中毒症状，并在临床上表现为呕吐、腹泻、以及致热等症状，因此限制了其临床应用和治疗可得效果。前期研究中，曾经改变了MHCII的结合能力，但发现随着毒性降低，其抑瘤活性也有显著降低，临床应用前景不大。

因此，一方面减少肠毒素C2作为细菌外毒素所带来的毒副作用，另一方面保留或增强其超抗原活性和肿瘤抑制能力，进而提高肠毒素C2在未来抗肿瘤方面的开发潜力，本发明通过基因定点突变技术对SEC2中与毒性和超抗原活性相关的位点进行突变，从而达到降低毒性且保持抑瘤活性的目的，所构建的肠毒素C2超抗原突变蛋白具有极高的临床药用前景。

发明内容

本发明目的在于提供具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白和编码基因及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白，所述具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白具有序列表SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6中的氨基酸序列。

一种具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白的编码基因，所述编码基因具有序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中碱基序列。

具有药用前景的肠毒素C2超抗原突变蛋白的制备方法：

以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用特异性PCR引物sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCCATT CTT TGT TG-3’扩增出SEC2全基因sec2；

在此基础上，以SEC2全基因sec2为模板，采用引物对sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和R-Mutant：5’-TAT TTT CCA TCAAAC CAG TAA ACT CAC TTG-3’；F-Mutant，5’-GTT TAC TGG TTT GAT GGA AAATAT GAA ATA T-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列sec2m突变基因；

以具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列sec2m基因为模板，采用引物对sec2-F：5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3’和P1：5’-GGA ATAACA AAA GCT GAA GGA AAC CAC-3’；P2：5’-GGT TTC CTT CAG CTT TTGTTA TTC C-3’和sec2-R：5’-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列sam-1突变基因；