[发明专利]一种编码苦瓜多肽P的核酸序列

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码苦瓜肽P的核酸序列及含其的重组载体和转化体。

背景技术

苦瓜为葫芦科苦瓜属植物，性味苦寒，具有清暑涤热，滋养强壮，降血糖等功效。关于苦瓜的性味、归经、功效，《滇南本草》称“苦、寒、平，入心、脾、胃三经……泻六经实火，清暑、益气、止渴”。《本草纲目》苦瓜条谓“苦寒、无毒、除邪热、解劳乏，清心明目”。清代张璐在《本经逢原》中也称苦瓜“为除热解烦，清心明目之品”。《福建中草药》载有以鲜苦瓜切碎水煎治疗烦热口渴的验方。中医无糖尿病之病名，而从其临床特征、症状表现上看属中医“消渴病”范畴。中医学认为：消渴病初起，多以燥热为主，病程迁延，则阴虚与燥热互见，病久则以阴虚为主。苦瓜“青则涤热、明目清心。熟则养血滋肝，润脾补肾”(《随息居饮食谱》)与所治消渴病之病机相一致[1]。

苦瓜降糖作用已为实验和临床所证实，其降糖活性成分的研究也日趋深入。早在1960年，研究表明正常的及四氧嘧啶型糖尿病家兔灌服苦瓜浆汁后，其血糖水平明显降低。此后各国药学工作者开始致力于寻找苦瓜中的降糖活性成分。自1965年Sucrow从苦瓜果实中提取分离出苦瓜甙后，科学家们发现和证实了苦瓜甙是苦瓜降血糖的有效物质。有学者发现苦瓜的降糖成分可能还包括生物碱和类胰岛素两种类型的物质。目前已知的苦瓜多肽有三种，分别为多肽-P，多肽-K和MC6。

1979年，Khanna等首先从苦瓜果实中发现一种水溶性类胰岛素物质，称为多肽-P。多肽-P只有一条肽链，由166个氨基酸残基构成，含17种氨基酸，分子量11000，肌肉注射显示降血糖作用，但口服无活性。1993年，我国学者王敬文等也报道从苦瓜果实中分出降血糖蛋白PA，分子量约38000[15]。

Khanna还从苦瓜种子中分离出一种称为多肽-k的降糖活性物。多肽-k有两条肽链，含18种氨基酸，分子量18000，不溶于水。605例病程2～20年的2型糖尿病患者舌下口服多肽-k(12mg/次，4次/d)，降糖效果十分明显。

MC6则是从鲜苦瓜汁提取的水溶性多肽，包括MC6.1、MC6.2和MC6.3三种单链多肽，长度分别为18、11和7个氨基酸，MC6.1、MC6.2多肽C端7个氨基酸序列与MC6.3多肽完全相同。动物实验表明，这三种多肽不仅经静脉注射给药有突出的降血糖效果，而且它们还表现有明显的口服降血糖活性。

其中，苦瓜多肽P的氨基酸序列已知，本领域技术人员通过氨基酸序列可推断出苦瓜多肽P可能的核酸序列，但却一直未能获得天然苦瓜多肽P的核苷酸序列，这可能与基因表达的特殊性有关。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于解决苦瓜多肽P核酸序列未知的问题，而导致不能对苦瓜多肽P的生物学功能进行深入研究并由此进行应用开发的困境。

为此，本发明公开了一种编码苦瓜多肽P的核酸序列，其特征在于所述核酸序列编码了如SEQ ID NO.1所示的被称为苦瓜多肽P的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述核酸序列为如SEQ ID NO.2所示或至少与SEQ ID NO.2所示的核酸序列90％同源性且具有降糖活性的核酸序列。

另一方面，本发明公开了一种重组载体，其特征在于其含有编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核酸序列。

在一些实施例中，所述核酸序列为如SEQ ID NO.2所示或至少与SEQ ID NO.2所示的核酸序列90％同源性且具有降糖活性的核酸序列。

另一方面，本发明还公开了一种转化体，其特征在于其包括表达氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的重组载体。

另一方面，本发明公开了上述编码苦瓜肽P的核酸序列的制备方法，包括下列步骤：

苦瓜种子全RNA的抽提；

RT-PCR及兼并PCR；

回收PCR产物并连接到T载体，转化，摇菌，测序；

染色体步移；

回收PCR产物并连接到T载体，转化，摇菌，测序。

另一方面，本发明还公开了一种8-100个核苷酸的探针，其特征在于所述探针的序列可识别如SEQ ID NO.2所示核酸序列。

另一方面，本发明还公开了所述探针在生物检测或基因克隆中的应用。

另一方面，本发明还公开了另一方面，本发明还公开了一种反义核酸药物，其特征在于所述反义核酸药物包含反义核酸和药学上可接受的载体，所述反义核酸与如SEQ IDNO.2所示核酸序列配对。