[发明专利]西地那非及其衍生物的人工合成抗原的工艺

说明书

技术领域：

本发明涉及一种西地那非及其衍生物的人工合成抗原的工艺。

背景技术：

西地那非(Sildenafil)，又译昔多芬，是一种研发治疗心血管疾病药物时意外发明出的治疗男性勃起功能障碍药物，一般以其商业用名Viagra(中国大陆注册名万艾可，台湾和香港注册名威而钢)广为人知。不过相对于商品名西地那非在中国的俗名“伟哥”使用的更广泛，影响也更大。目前，在国内好多中成药或保健品中非法添加西地那非以达到临床的疗效，作为患者，在长期不知情的情况下服用含有西地那非的中成药或保健品会引起严重的副作用，检测中成药或保健品中是否含有伟哥成分时，采用的是传统的检验方法，须将提取的样品带回实验室进行分析，或是使用大型的试验车，这样都很不方便，而且反应时间长，实验耗资较大。

发明内容：

本发明的目的是为了克服以上的不足，提供一种操作方便的西地那非及其衍生物的人工合成抗原的工艺。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种西地那非及其衍生物的人工合成抗原的工艺，包括以下步骤：

A、生成水溶性碳化二亚胺(EDC)：

(1)、烷基化：往反应瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非类原料或拉非类原料，并通N₂保护，在室温下进行搅拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快速称取浓度为60％的氢化钠(NaH)，并将其加入所述反应瓶中，搅拌50-70分钟，直至溶液无气泡产生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反应瓶中，注入完毕后，在室温下搅拌11-13小时，之后将反应液倾入水中分散，以氯仿进行提取，合并提取液，以无水Na₂SO₄进行干燥，之后过滤，再经过减压浓缩后得到固体，加入无水乙醚打浆洗涤所述固体，之后进行过滤，最后真空干燥得到新的固体，此固体为烷基化物；

(2)、水解：将无水乙醇和上述步骤所得的烷基化物加入新的反应瓶中，进行搅拌分散，再加入NaOH溶液，加热回流反应2小时，停止加热稍冷却后，将反应液转入单口瓶中，减压浓缩得糊状物，再加入水，以盐酸调节至pH值为7-9的液体，以氯仿进行提取，合并提取液，再用饱和食盐水洗一次，以无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压浓缩得白色固体，用甲醇重结晶，得白色粉状固体，此固体为水溶性碳化二亚胺(EDC)；

B、生成人工合成抗原：

(1)、将上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室温；

(2)、取上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物，三者的摩尔比为：半抗原化合物∶水溶性碳化二亚胺∶N-羟基琥珀酰亚胺＝1∶8-12∶13-16，将其置入圆底烧瓶，然后加入上述步骤中所得的二甲基甲酰胺溶解，为保证反应完全，在室温避光的条件下进行搅拌，最后生成的溶液记为二号反应液；

(3)、当水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物在二甲基甲酰胺中反应完全后，现配载体蛋白溶液(BSA/KLH)，将载体蛋白与硼酸缓冲液按1∶0.15-0.2的量溶解于另一容器中的硼酸缓冲液，然后转入另一圆底烧瓶中，此溶液记为三号反应液；

(4)、将二号反应液按每10秒1滴的速度滴入三号反应液中，直至将二号的反应液加完后，先在室温避光的条件下进行搅拌，之后在3-5℃条件下避光搅拌，待反应完全后，生成溶液，并将生成的溶液记为四号反应液，四号反应液中载体蛋白与半抗原化合物比例为：1∶15-25；

(5)、等所有反应结束后，将四号反应液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋中还装有0.01-0.02M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0-7.5，将透析袋在3-5℃的条件下进行透析，每隔3-5小时换一次磷酸盐缓冲液；

(6)、经上述透析步骤最终所得的产品，经冷冻干燥为白色絮状产品，即为人工合成抗原。

本发明的进一步改进在于：步骤B(2)中，三者的摩尔比的最佳比值为：半抗原化合物：水溶性碳化二亚胺∶N-羟基琥珀酰亚胺＝1∶10∶15，且在室温避光的条件下搅拌三者的混合液22-26个小时。

本发明的进一步改进在于：步骤B(4)中，先在室温避光的条件下搅拌1-3小时，之后再在3-5℃条件下避光搅拌46-50小时。