[发明专利]纳米吸附改善酶稳定性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高酶稳定性的方法，特别涉及一种以纳米颗粒作为酶吸附载体改善酶稳定性的方法。

背景技术

酶是由蛋白质组成，其空间结构对所处的环境十分敏感。一般情况下，对热、强酸、强碱、有机溶剂等均不够稳定，在反应中易失活。天然酶的不稳定性大大限制了其应用领域和应用效果，选择适宜的载体对酶进行固定化可以提高酶的稳定性。

在酶固定化采用的方法中，吸附法是最简单的一种方法。它的最大优点是工艺简便、条件温和，酶分子不会被破坏，得到的固定化酶稳定性好。

通过吸附作用对酶的稳定性进行改善，关键的问题是选择合适的载体。在众多载体中，纳米二氧化硅是比较常见的一种无机载体，它具有较高的表面能和生物相容性，价格低廉。此外，还有较高的机械强度有利于在生物反应器中进行工业生产。因此，在通过吸附对酶进行固定化中具有较高的应用价值。

载体粒径大小、载体和酶吸附的方式直接影响固定化酶的稳定性，目前的研究结果已经证实，纳米载体优于微米载体。但是，目前采用正硅酸乙酯与N-(β-氨乙基)-氨丙基三乙氧基硅烷在油包水形成的微胶囊中同步水解的方法，一步法制备了氨基化的二氧化硅颗粒，以此作为载体，通过戊二醛作为交联剂，采用共价法对不同酶进行固定化。此种方法固定化时间长达几十小时，操作复杂，同时，由于交联剂的存在，不利于保持较高的酶活力，酶稳定性改善不显著。

发明内容

本发明在最大限度提高酶活保持率情况下，提供一种改善酶稳定性的方法。采用纳米SiO₂作载体，调整介质的pH，利用酶和纳米载体所带电荷不同，自组装形成酶-载体聚合体，从而达到提高酶稳定性的目的。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

纳米吸附改善胰蛋白酶稳定性的方法：分别用pH4.0-10.0的缓冲液配制3.3mg/mL，10mg/mL和30mg/mL胰蛋白酶溶液，再用相同pH的缓冲液配制10mg/mL纳米SiO₂溶液。各取10mL胰蛋白酶溶液和纳米SiO₂溶液使酶和载体质量比实现1∶3，1∶1和3∶1三个比例，在室温下，用电动搅拌器搅拌吸附3h。所述胰蛋白酶是一种常用的动物蛋白酶，酶活力单位为285U/mg，酶解最适pH7.8，最适温度37℃。所述纳米SiO₂粒径分布均一，分别为20nm、100nm、300nm。

以吸附后的酶活保持率、热稳定性和酸碱稳定性为指标，吸附pH优选为7.8，酶和载体质量比优选为1∶1，载体SiO₂粒径优选为20nm。

本发明另一种通过纳米吸附改善木瓜蛋白酶稳定性的方法：分别用pH4.0-8.0的缓冲液配制3.3mg/mL，10mg/mL和30mg/mL木瓜蛋白酶溶液，再用相同pH的缓冲液配制10mg/mL纳米SiO₂溶液。各取10mL木瓜蛋白酶溶液和纳米SiO₂溶液使酶和载体质量比实现1∶3，1∶1和3∶1三个比例。在室温下，用电动搅拌器搅拌吸附3h。所述木瓜蛋白酶是一种来源广泛的植物蛋白酶，酶活力单位为617U/mg，酶解最适pH6.0，最适温度50℃。所述纳米SiO₂粒径分布均一，分别为20nm、100nm、300nm。

以吸附后的酶活保持率、热稳定性和酸碱稳定性为指标，吸附pH优选为6.0，酶和载体质量比优选为1∶1，载体SiO₂粒径优选为20nm。

本发明采用以纳米颗粒作为酶吸附载体改善酶稳定性的方法，与现有技术相比具有以下优点：

1.通过调整pH使纳米SiO₂载体和酶带有相反电荷，通过静电吸附的物理方法完成酶的固定化，避免了现有化学方法对酶分子结构的影响与破坏，使吸附后酶活性保持率较高。

2.吸附时间与传统的化学交联法相比明显缩短。本方法吸附时间仅需3h甚至更短，而传统的化学交联法要长达几十个小时。

3.与化学交联法和微米SiO₂固定化酶的方法相比，本方法可以更有效提高酶稳定性。化学交联法对木瓜蛋白酶固定化后，80℃时固定化酶活力较游离酶提高了53％，常规微米SiO₂吸附后提高了25％，而本发明采用的方法提高了82％。

4.本发明的方法操作简单，酶稳定性改善显著，易于推广，具有较高的经济效益。

具体实施方式