[发明专利]转红色荧光蛋白基因唐鱼聚合酶链式反应（PCR）检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及对转红色荧光蛋白基因唐鱼特异的检测方法。

背景技术

唐鱼（Tanichthys albonubes）是一种原产中国广州市白云山附近溪流，我国特有的小型鲤科鱼类，属于我国二级野生保护动物。由于唐鱼具有独特的观赏价值，现已流传至世界各地，成为人们喜爱的观赏鱼品种。唐鱼体背棕色或青棕色，体侧有三道色彩条纹谱带，从上至下分别为金黄或红黄、青铜绿、靛蓝，以金黄或红黄带为主，故其被称为“白云金丝鱼”。唐鱼不仅具有观赏价值，还因其具有体型小、繁殖周期短、饲养条件要求低、容易在实验室条件下实现纯化培育、具有连续产卵特性、卵膜透明、胚胎发育可观察等特点，可作为发育生物学、环境监测的实验动物模型，具有很高的、潜在的科学研究的价值。

转红色荧光蛋白(red fluorescent protein, RFP)基因唐鱼是本实验室利用显微注射法，将线性化的红色荧光表达载体(pDsRed-mylz2)注射入唐鱼的受精卵而获得的，该转基因唐鱼通体红色，颜色均匀、色彩艳丽，是一个具有极大观赏价值和科研究价值的新品种。随着转基因生物的不断出现和大规模应用，转基因技术及其产品也引发了全世界对其潜在生物安全问题的广泛讨论和关注。转基因生物安全主要指通过基因工程技术所产生的遗传工程体及其产品的安全性问题，即指在转基因生物体的实验研究、中间试验、规模化生产、市场化过程中，因转基因生物体释放、生产、使用和处置的不当，而可能对人类赖以生存和发展的自然生态环境构成难以估量的风险。评估转基因生物是否安全，主要是从三个方面看，一是转基因生物的食品安全性；二是从生态上讲是否安全，转基因个体经人为定向改造后，往往生长更快，或抗病力、抗逆性增强，一旦释放到自然界，可能破坏原有的种群生态平衡；三是从遗传上讲，如果转基因生物释放到自然界，与野生种交配导致外源基因的扩散，威胁物种的遗传多样性。转红色荧光蛋白基因唐鱼不作为人类的食用鱼，所以一般不具有食品安全问题，但如果转基因唐鱼被人为无意识地释放到自然界，是否会引起生态和和遗传多样性的改变问题，是科研工作者必须关注的问题。建立一种方法，定期抽样检测野生的唐鱼是否有外源红色蛋白基因的存在，检测实验室中表型特征出现之前的鱼苗是否为转红色荧光蛋白基因唐鱼，是非常必要的。

目前，转基因动物的检测方法有许多种，如整体表型观察法、生物化学性质及生物活性检测法、DNA-斑点杂交法、Southern杂交法、染色体原位杂交法、Northern杂交法、RT-PCR法、RNase保护分析法、蛋白免疫技术检测法等。整体表型观察法是从动物整体水平上观察表现型的改变，分析基因型对动物整体性状和生理功能的影响。转红色荧光蛋白基因唐鱼目前主要采用的检测方法就是整体表型观察法，但要等到小鱼长到一个月左右，才能观察到红色，要想更加早期的鉴定就要采取其它有效的检测办法了。红色荧光蛋白的生物化学性质及生物活性检测方法繁琐，费时费力，不适用于对于转红色荧光蛋白基因唐鱼的检测。DNA-斑点杂交法在分析基因组DNA时，对样品纯度要求低、简便经济、灵敏度高，但该方法易出现假阳性。Southern杂交法对样品的质量和纯度要求较高，操作烦琐，费用也较高。染色体原位杂交法可以检测外源基因在染色体上的具体位置，但成本高、操作烦琐，不适合大批量快速检测的转基因唐鱼要求。Northern杂交法、RT-PCR法、RNase保护分析法是检测外源红色荧光蛋白mRNA的表达，需求提取RNA，实验操作要求高、步骤烦琐，不适合转红色荧光蛋白基因唐鱼的检测。蛋白免疫技术检测法要等外源红色荧光蛋白基因经过转录、翻译成蛋白后，才能检测得到，也不适合转红色荧光蛋白基因唐鱼的早期检测。PCR检测方法具有所需样品少、灵敏度高、操作简便、检测快速等优点，被广泛应用于转基因动物的检测。PCR检测方法比DNA-斑点杂交法操作更加简便、易掌握。

本实验室根据转红色荧光蛋白基因唐鱼外源红色荧光蛋白基因序列设计引物，建立了快速、有效的能特异性检测转红色荧光蛋白基因唐鱼的PCR方法。PCR检测方法比DNA-斑点杂交法操作更加简便快速、容易掌握。

发明内容

本发明是为了建立一种快速、准确、有效的早期检测转红色荧光蛋白基因唐鱼的方法。

根据外源的红色荧光蛋白基因序列设计了一对特异性扩增红色荧光蛋白基因的引物，经过优化反应体系和反应条件，认为退火温度64℃为最适的退火温度，以转红色荧光蛋白基因唐鱼基因组DNA为模板扩增出一条487bp的片段，以野生型唐鱼基因组DNA为模板进行扩增，没有扩增产物。检测同时设有阳性质粒对照和阴性对照。