[发明专利]在酵母中高效表达N-酰基高丝氨酸内酯酶的DNA及其构建的工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及在酵母中高效表达N-酰基高丝氨酸内酯酶的DNA及其构建的工程菌。

背景技术

由于遗传密码具有简并性，一种氨基酸可以有1-6个使用频率不同的同义密码子。对于特定的物种，高表达的基因往往使用部分特定的同义密码子，这些密码子被认为是该物种高表达基因的优越密码子(optimal codon)，这种现象称为密码子偏爱性(codon bias)。密码子的偏爱性使得克隆的外源基因往往难以在异种生物细胞高效表达。在酵母中获得高效表达的外源基因往往都是酵母偏爱密码子所编码的基因，通过对酵母基因使用密码子的统计分析证实所有的61个密码子中有25个是酵母所偏爱的，因此对密码子进行偏爱性改造能大量提高重组蛋白在该系统中的表达量。

N-酰基高丝氨酸内酯酶是一类特异性降解N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子(AHLs)的蛋白水解酶，通过水解AHLs生成酰基高丝氨酸，使AHLs失去活性，从而阻断病原菌的群体感应机制，使病原菌失去致病能力，其广泛存在于多种微生物中。近年来N-酰基高丝氨酸内酯酶作为一种新型抗菌策略(群体感应淬灭策略)的工具酶而成为研究的热点。

目前主要是通过构建转基因植物、转基因细菌研究其在群体感应淬灭中的作用机制，而转基因植物或转基因细菌在实际应用中存在生物安全和有效性方面的问题。

发明内容

本发明的目的是提供在酵母中高效表达N-酰基高丝氨酸内酯酶的DNA及其构建的工程菌。

本发明提供的DNA分子，为如下(a)或(b)：

(a)序列表的序列2自5’末端第7至759位核苷酸所示的DNA；

(b)序列表的序列2所示的DNA。

含有所述DNA分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体可为在pPIC9载体的多克隆位点插入所述DNA分子得到的重组质粒，优选为在pPIC9载体的EcoR I和Not I酶切识别位点之间插入所述DNA分子得到的重组质粒。

所述重组菌可为在宿主菌中导入所述DNA分子得到的重组菌，具体可为在宿主菌中导入所述重组表达载体得到的重组菌。所述宿主菌可为毕赤酵母(Pichia pastoris)，具体可为毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，优选巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)AiiA-B546M，CGMCC No.3975。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)AiiA-B546M，CGMCC No.3975已于2010年7月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.3975。

所述的重组菌可用于生产N-酰基高丝氨酸内酯酶。

本发明还保护一种生产N-酰基高丝氨酸内酯酶的方法，是培养所述重组菌，得到N-酰基高丝氨酸内酯酶。

所述方法具体可为：30℃、250-280rpm(4-5×g)培养所述重组菌，得到N-酰基高丝氨酸内酯酶；培养过程中采用甲醇诱导。所述甲醇在所述培养液中的浓度优选为0.5％(体积百分含量)。所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的底物具体可为N-3-氧-辛酰高丝氨酸内酯(3-oxo-C8-HSL)。

本发明在现有N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiaB546的基础上，对其DNA序列进行优化，改造成酵母偏爱密码子所编码的基因，得到了优化后的基因aiiaB546M，该优化后基因在毕赤酵母中的表达能力显著高于优化前基因。本发明构建了含有aiiaB546M的重组表达质粒，将该重组表达质粒导入毕赤酵母，可以得到高效高丝氨酸内酯酶的重组菌。其中一株重组菌的表达能力尤为高效。本发明可以降低N-酰基高丝氨酸内酯酶生产成本，提高应用的安全性和有效性，对于高丝氨酸内酯酶的生产具有重大价值。

附图说明

图1为优化前基因和优化后基因的比对。

图2为aiiaB546M/pUC57的电泳图；1为1kb plus ladder Marker；2为质粒aiiaB546M/pUC57。

图3为酶切后质粒的电泳图；1为为pPIC9载体双酶切片段；2为质粒aiiaB546M/pUC57双酶切后的两条片段，目的基因aiiaB546M为753bp；3为1kb plusladder Marker。

具体实施方式