[发明专利]诱导型启动子携带Glu基因培育抗青枯病烟草的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种诱导型启动子携带Glu基因培育抗青枯病烟草的方法，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

青枯病是烟草种植过程中的主要病害之一，每年因青枯病的危害给烟草的产量与质量造成巨大的损失。烟草是四倍体，遗传背景相当复杂，抗常规育种来选育抗青枯病的烟草品种很难实现，加之育种年限过长，不能满足我国烟草生产的要求；且目前对于烟草青枯病的防治尚无特效药，因此通过药剂进行防治不能满足烟草生产的要求，加上过度的施用农药本身对烟草的生长与烟叶的产量也不利。随着基因工程技术手段的发展，为选育抗烟草青枯病的转基因烟草提供了有利的基础。

   烟草青枯菌从植物根部侵入，首先在根皮层细胞间隙等处定殖，然后在导管及相邻组织内迅猛增殖和广泛散布，由此产生维管系统的阻塞和破坏，最终导致植物枯萎死亡（TsuGluyaK 2004）。青枯病菌还分泌细胞外多种细胞壁降解酶（如纤维素酶类和果胶酶类），其可能也在破坏导管组织，引起植株枯萎死亡方面起重要作用（何礼远和康耀卫，1995）。

转基因技术的快速发展，通过将外缘基因导入烟草进行功能验证或者抗病选育已经有很多报导，同时对转基因安全性也得到了普遍的关注，特别是1998年转GNA马铃薯的“普斯陶伊事件”和1999年转Bt玉米的“斑蝶事件”引起了人们对转基因作物的恐慌与担忧。因此通过植物基因工程技术手段来解决烟草烟草抗病育种首要的是考虑到转基因的安全性。因此选择启动子、目的基因，让目的基因在烟草怎么样表达已经成为当前科研的热点。Glu基因与几丁质酶基因广泛运用于转基因上，Glu基因经修饰后转化烟草，其胞外产物能对镰刀菌（Fusariumsolani）呈现抑菌活性（Sela-BuurlageMB，etal.1993）。β－1，3－葡聚糖酶基因转入烟草，转基因植株后代具有良好抗炭疽病和黑胫病的能力（黎定军等，2002）。诱导型启动子主要是一类受某些物理或化学信号的刺激而能大幅度地提高基因在特定时期、特定部位的转录水平的启动子（SubramanianS2002）。已有很多报道关于诱导型启动子的研究，有热诱导启动子、干旱诱导启动子、激素诱导启动子、机械损伤诱导启动子，当然很多诱导型启动子的活性的启动可受多因素的诱导（赵恢武2000；XuD1993；李婵娟2006；李秋莉2006；ZhuJun2005）。

本发明就是针对以上背景技术，通过分子生物学克隆烟草诱导型启动子P1，以及烟草β-1，3-葡聚糖酶基因Glu，通过中间载体，将目的启动子、目的基因整合在一起，构建植物表达载体。建立了以抗生素为筛选剂的转基因遗传转化体系，通过农杆菌介导法，培育转基因烟草，以及高效的分子检测手段及抗病鉴定。诱导型启动子与Glu基因都来自烟草基因组中的核苷酸序列，因此为安全、高效的解决烟草青枯病培育奠定了良好的技术基础。

发明内容

本发明提供了一种诱导型启动子携带Glu基因培育抗青枯病烟草的方法。利用转基因技术安全、有效地改良烟草抗青枯病。

本发明的利用诱导型启动子携带Glu基因培育抗青枯病烟草的方法，将烟草基因组中的诱导型启动子P1核苷酸序列与抗病基因Glu整合在一起，培育转基因烟草，让诱导型启动子调控抗病基因在受病原菌侵染时表达。

具体地说，从烟草中克隆诱导型启动子P1、抗病基因Glu，构建了植物表达载体，利用农杆菌介导法，将基因转入烟草翠碧一号中。

 本发明利用烟草诱导型启动子P1与烟草抗病基因Glu培育抗青枯病烟草新材料，包括烟草诱导型启动子P1及烟草抗病基因Glu的克隆，构建植物表达载体，抗烟草青枯病新材料的培育，以及抗病新材料的分子检测筛选、青枯菌的接种鉴定，其特征在于：

1.克隆得到诱导型启动子的核苷酸序列来自于翠碧一号烟草品种，具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

2.克隆得到烟草β-1，3-葡聚糖酶基因即抗病基因Glu的核苷酸序列来自于三生烟草，具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。

3.将这两个核苷酸序列整合到中间载体上，获得的载体命名为PSC1300-P1-Glu，其中中间载体指的是PCAMBIA1300，启动子P1是指烟草诱导型启动子,基因Glu是指烟草β-1，3-葡聚糖酶基因。

4.将载体引入农杆菌，离体转化烟草叶片，培育获得转基因烟草。